Name: のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 学ぶ負の選択マーカー開発法。Entamoeba histolyticaでFCU1キメラタンパク質と5-フルオロシトシンを用い、トランスフェクション細胞を選択的に除去する遺伝子操作技術を解説します。

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我々はFCU1遺伝子の配列を我々に提供するための博士フィリップのERBSを感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金AI 26649によってサポートされていました。

1。 赤痢アメーバのFCU負の選択システム<ol><li>ベクトル制御ライン（HM1 / pKT3M）と実験ライン（HM1/pKT3M-FCU1）は、前述のテクニックの1,2により生成された。シードはT - 25フラスコにストックチューブから研究対象の行とTYI - S - 33 3培地で適切な抗生物質（12μg/ mlのG418）を追加することで選択を維持する。フラスコは37℃で成長の16〜18時間後に70から80パーセントコンフルエントになるはず℃に</li><li>暖かいTYI - S - 33培地中で5 - フルオロシトシン（5 - FC、シグマ）の新鮮な50mmのストック溶液を準備します。完全に5 - FCを溶解するのに数分間、厳密に渦。 0.22μmのフィルターを通すことでストック溶液をろ過滅菌します。 </li><li> 3〜5分間氷上にフラスコを置き、室温で5分間200xgで遠心分離により細胞を収集することによって収穫のトロフォゾイト。新鮮TYI培地にペレットを再懸濁し、細胞を数えます。 </li><li>典型的な実験のデザインは、1mLの最終容量で48ウェルプレートのウェル当たり0.5 × 10 4細胞を使用して、そして、各テスト条件のための三連を繰り返す。さらに、蛍光測定を容易にするために、別々のプレートは、1時点の各系統に使用されます。 </li><li>各テスト5 - FCの濃度、三連のために、ウェルあたりの種子0.5 × 10 4細胞。 TYI培地中の抗生物質選択圧を維持する。今すぐ5 - FCのストック溶液を各ウェルにトロフォゾイトの必要量を追加します。 </li><li> 37℃で嫌気袋でプレートをインキュベート℃に</li></ol> 2。選択効率の決定<ol><li> 2 mgを/ DMSOでセルトラッカーグリーンCMFDA（Invitrogen社）のmlストック溶液を調製。ワーキングソリューションを作成するには、無血清TYI媒体の株式1000倍に希釈する。 </li><li>栄養型培養プレートから完全に培養液を除去し、150μLの無血清TYI含むCMFDAと交換してください。 37℃インキュベーションを続ける℃で1時間。 </li><li>井戸から染料溶液を除去し、Spectramax M2マイクロプレート光度計でプレートを読み取る。励起波長492nmで設定し、蛍光発光は517 nmで測定されるべきである。 </li><li>テストのトランスフェク対コントロールの細胞の蛍光値を比較します。 </li><li>各時間間隔でプレートの読み取りを続けます。各プレートに適切な正（TYIのみ）と負（25μg/ mLのハイグロマイシン）コントロールウェルを使用してください。 </li></ol> 3。代表的な結果 E.赤痢のトランスフェクタントは、コドン最適化された組換えFCU1（図1）の強い発現を示した。このプロトコルはEの選択的除去では、結果が正しく実行されている場合赤痢は、細胞を0.5mMの5 -フルオロシトシンの存在下でFCU1を表現する。コントロール細胞は、対照的に5 - FCの5 mMの濃度までで正常に成長し、72および96時間（図2）との間でコンフルエントに達するために引き続き。処理された井戸が顕微鏡で観察しているときに48時間でFCU1持つ細胞が完全に溶解されています。これらはまた、サンプル（図2 - B）の多数を含む定量的な研究で使用されている生体染色色素CMFDA、で染色したときの蛍光の減少を示す。 FCU1/5-FCシステムはE.のための効果的かつ強力な負の選択ツールです。 赤痢はトロフォゾイト。 <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 E.の世代負の選択マーカーを発現赤痢 HM1トランスフェク （A）FCU1組換えタンパク質は、抗c mycの抗体（上部パネル）を使用してウェスタンブロットで検出された。予想通り、42kDaバンドは、FCUのトランスフェクタントからではなく、コントロールのトランスフェベクター単独で合計ライセートに（矢印で示す）を検出することができた。下のパネルは同じブロットのローディングコントロールとして抗アクチン抗体でプローブを示しています。 （b）の定量的リアルタイムPCRの結果はlgl4コントロールに正規FCU1特定のmRNAの発現を示す。 <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 E.の in vitro薬剤感受性の負の選択マーカーを発現赤痢のトランスフェク （a）制御トランスフェクタントと（b）FCU1表現するトランスフェクタントは、48ウェルプレートで培養の生存曲線。細胞は濃度の増加の存在下で成長させたプロドラッグ5 - フルオロシトシン、X軸に示されるように、細胞の生存率は各時間間隔でCMFDA染色により定量した。 Y軸は蛍光の単位を表し、生き残った細胞集団を直接反映しています。 FCU1表現するトランスフェクタントは、コントロールと比較して0.5mmのプロドラッグの濃度で有意な感度を示したことに注意してください。セルがCOMとして、これらの井戸で120Hの時点で観察されなかった顕微鏡下で対応するコントロールウェル（データは示さず）に見られるようにコンフルエントに成長して比べ。 Hygroは、ネガティブコントロールとして使用される25μg/ mLのハイグロマイシンを表します。

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
<li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica%3A+implications+for+approaches+to+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li>
<li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukaryot.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li>
<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
<li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li>
<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

このビデオの制作は、この記事で使用する試薬の一部を生成するシグマアルドリッチ株式会社後援した。

赤痢アメーバの分子生物学的ツールの大幅な進歩があったが4の遺伝子を削除したり、混乱させるために利用できる現在の方法はありません。遺伝子特異的発現のノックダウンは、ヘアピンRNA 5の使用によって達成低分子干渉RNA 6と細菌のdsRNA 7を発現されている。しかし、それぞれの標的遺伝子の中に効果的なこれらの方法は、高価な化学物質の使用、抗生物質と時間の経過とともに発生復帰の高い発生率に起因する一定の検証の必要性に対する継続的な選択（アリシアリンフォード、私信）8を含むいくつかの制限があります。 DNA複製9の起源のための厳密な順序の要件が明らかにないとして、任意のプラスミドは、 赤痢アメーバに複製することができ、ので、一度トランスフェクション、それは通常、プラスミドを治すことは困難です。これは、組換えと遺伝子ノックアウト実験で無傷プラスミドの活用可能性を制限する。負の選択マーカーは、それらが組換え亜集団を排除するために使用できるようにメソッドを遺伝子ターゲティングの重要なコンポーネントです。私たちは正常にコドン赤痢アメーバでFCU1遺伝子を最適化し、負の選択マーカーとしての可能性をテストを表明している。この遺伝子の融合は、ヒト腫瘍細胞の自殺遺伝子治療のために使用され、RNAとDNA合成10の阻害をもたらす有毒な川下製品へのプロドラッグ5 - FCを代謝されています。 FCU1は最近マラリア 、別の原生動物寄生虫における負の選択マーカーとして使用されています。FCU1を表現マラリアberghei細胞は 5 - FCとのin vitroおよび in vivo治療におけるプロドラッグへの約1000倍感度が高くなることが判明したのは、99.9％以上死滅マラリア11の赤血球段階のマウスモデルにおける組換え寄生虫に感染。E.は FCU1を発現している赤痢細胞はP.で観測された感度とは対照的にプロドラッグ5 - FC〜30倍高い感度を示したberghei。このために考えられる理由は、有毒な代謝産物と競合する増殖培地で利用可能なヌクレオチドの大規模なプールである可能性があります。 P.両方のbergheiとP.熱帯熱マラリア FCU1マーカーは、標的遺伝子破壊に使用されています。研究11,12。我々は、相同組換えを用いた赤痢アメ​​ーバのゲノムを操作することを目指しています。 FCU1/5-FCネガティブ選択系の検証は、この目標に向けた重要なステップです。

<table><tbody><tr><td>TYI-S-33培地</td><td>ATCC</td><td></td><td>本文中に記載の参考文献を参照</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-フルオロシトシン&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Cell tracker green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max M2プレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

赤痢アメーバはアメーバ症の原因物質であり、世界人口の10％まで感染します。遺伝子発現のアップとダウンレギュレーションを有効にしている分子技術は、安定的に維持プラスミドのトランスフェクションに依存しています。これらは、赤痢アメーバの病原因子についての理解を増加している一方で、逆遺伝学の実験を可能にするゲノムに外来DNAを統合する能力は、、この寄生虫の研究で大きな利点となります。この微生物によって提示される課題は、相同組換えのイベントとトランスフェトロフォゾイトからエピソーム、プラスミドDNAを治すために困難のために選択することができないことなどがあります。外因性DNA、善意のゲノム統合イベントが発生したトロフォゾイトの同定における主要な問題の高バックグラウンドで後で結果。我々は、酵母のシトシンデアミナーゼとウラシルプロドラッグ5 - フルオロシトシン（5 - FC）とホスホトランスフェラーゼキメラ（FCU1）と選択のトランスジェニック発現に基づいて、負の選択シス​​テムの開発について報告する。 FCU1酵素は毒性の5 -フルオロウラシル、5 -フルオロウリジン-5&#39; -モノリン酸。E.に非毒性の5 - FCを変換するFCU1を表現赤痢ラインはコントロール株と比較してプロドラッグに対してより敏感に30倍であることがわかった。

私達は中の負の選択シス​​テムの開発について報告する<em&gt; E.赤痢</em&gt;トランスジェニックキメラタンパク質の発現（FCU1）およびプロドラッグ5 - フルオロシトシンと選択に基づいて。 FCU1タンパク質は、酵母のシトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合です。 FCU1の発現は増加をもたらした<em&gt; E.赤痢</em5 - フルオロに向かって&gt;感度。

Entamoeba histolyticaはアメーバ赤痢の起因菌であり、世界人口の最大10%に感染しています。...を可能にした分子生物学的手法により、

本実験の全体的な目的は、Enterhistolyticaにおけるネガティブセレクション法として5-FC/FCU1システムの有用性を検証することです。48ウェルプレートにE. histolyticaを播種し、FCU1遺伝子または適切なベクターコントロールを発現するラインをトランスフェクションします。細胞をプロドラッグである5-FCで処理します。FCU1を高レベルで発現している細胞では、5-FCが有効量まで毒性のある最終産物へと変換されます。生存した細胞集団をCMFDAで染色し、5-FC存在下でFCU1発現細胞が選択的に除去されることを実証し、ネガティブセレクションの効率を定量的に比較します。このネガティブセレクションシステムを用いることで、トランスフェクションされたE. histolyticaから初めてエピソームプラスミドを除去することが可能になります。従来の遺伝子操作が困難であるという課題があるため、本手法を用いることで遺伝子の破壊および欠損が可能となり、創薬プログラムにおける標的VIR因子の検証が行えると考えられます。栄養体は、ストック培養の生育状況に個体差がある場合があります。初期段階でのミスはアーティファクトを誘発する可能性があるため、開始時の培養液の品質管理が極めて重要な初期ステップとなります。研究対象のinba hisa株をストックチューブからT 25フラスコに播種し、TYIS 33培地に適切な抗生物質を添加して選択圧を維持します。フラスコを37°Cで16時間インキュベートし、培養細胞が約80%のコンフルエンスに達するようにします。本手順では、常に温めたTYIS 33中で5-フルオロウラシル（FC）の50 mMストック溶液を調製してください。培地を数分間激しくボルテックスして5 FCを完全に溶解させ、0.22 µmフィルターでろ過滅菌してストック溶液を調製し、トロフォゾイトを回収します。フラスコを氷上に3～5分間置き、室温で200 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。沈殿物を新鮮なTYI培地で再懸濁し、その後の蛍光測定を容易にするために細胞数をカウントします。各タイムポイントおよび各菌株につき、独立した48ウェルプレートを用いてn=3で実験を行います。各試験において、1ウェルあたり0.5 mLの液量で0.5 × 10⁴ cellsを播種します。5-FC濃度を調整し、TYI培地で抗生物質による選択圧を維持します。次に、各ウェルに必要な量の5-FCストック溶液を加え、続いてTYI培地を加えて最終容量を1 mLにし、プレートを嫌気袋に入れて37 °Cでインキュベートします。CellTracker Green C-M-F-D-Aの2 mg/mLストック溶液をDMSOで調製します。次に、指定した実験時点において、このストック溶液を無血清TYI培地で1000倍に希釈し、ワーキングソリューションを作成します。Tropho Xite培養プレートから培地を完全に除去し、C-M-F-D-Aを含む無血清TYIを150 µL加えて置換します。37°Cでさらに1時間インキュベートした後、ウェルからDI溶液を吸引します。最後に、励起波長492 nm、蛍光 emission 波長517 nmに設定したSpectraMax M2マイクロプレート分光蛍光光度計でプレートを測定します。コントロール細胞とテスト導入細胞の蛍光値を比較してください。各時間間隔でプレートの読み取りを継続します。各プレートには、常に適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールウェルを使用してください。Western BLO解析により、酵母シトシンデアミナーゼとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのキメラであるFCU oneを発現するlyaトランスフェクトの作製に成功したことが示されました。これらの結果は、定量PCR測定にも反映されています。5-フルオロウラシル存在下において、コントロール細胞は5 mMまでの濃度で正常に増殖し、72時間から96時間でコンフルエンスに達します。対照的に、FCU1を発現するE. histolytica細胞は、明視野顕微鏡下において、0.5 mMのプロドラッグ存在下で選択的に除去されます。E. histolytica細胞を発現するFCUの5-FC薬に対する選択的応答は、細胞の溶解（クリアリング）によって確認できます。この場合、トランスフェクションの72時間後に培養します。この実験を行う際は、各タイムポイントで増殖をモニタリングすることが重要です。この手法はヒットアンドラン変異導入法に利用でき、本研究では Inba Hisa の病原性に関する重要な疑問を明らかにするために活用します。

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