モノクローナル細菌培養物を調製する技術

細菌培養から始めて、細胞密度を下げるために段階希釈を行います。

最終希釈液の少量のアリコートを取り、寒天プレートに置きます。

滅菌ガラスビーズを加え、プレートを軽く振って、十分に単離されたコロニーを得るために不可欠な細胞の空間的分離を確保します。

ガラスビーズを取り除き、プレートを反転させてインキュベートします。

個々の細胞は増殖して別々のコロニーを形成し、各コロニーが遺伝的に均一な細菌集団で構成されるモノクローナル培養物を生成します。

個々のコロニーを選択し、液体培地を含む別々のチューブに移します。

チューブを攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、各培養物の濁度を評価します。

培地に懸濁した細菌細胞は光を散乱させ、細胞密度の増加とともに培養物をより濁って見せます。

下流のアプリケーションでは、最も密度の高いモノクローナル細菌集団を示す濁度が最も高いチューブを選択します。

100ミリリットルのLBレノックスブロスで準備した3本のボトルに、1番、2番、3番のラベルを付けます。

得られた細菌培養物の0.1ミリリットルをボトル1にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振り回して均一な溶液を作ります。次に、ボトル番号1からボトル番号2に0.1ミリリットルをピペットで入れます。もう一度、ボトルに蓋をし、手で1分間振ります。ボトル番号2からボトル番号3に0.1ミリリットルをピペッティングして、最後の希釈を実行します。ボトルに蓋をし、手で1分間振ってください。

次に、20マイクロリットルの溶液を4つのペトリ皿のそれぞれにピペットで移します。次に、オートクレーブ滅菌した直径3ミリメートルのガラスビーズを4個ずつ各ペトリ皿に入れます。ペトリ皿の蓋を閉め、手で1分間振ってください。

終了したら、ペトリ皿を逆さまにし、プレートを摂氏37度のインキュベーターで24時間インキュベートします。

ステンレス鋼のへらを使用して、4つのペトリ皿から得られたモノクローナル細菌を取り出し、12.5ミリリットルのLBレノックスブロスを含む残りの7つのチューブに入れます。チューブを摂氏37度のインキュベーターに24時間放置し、視覚比色法を使用して光散乱が最も大きいものを選択します。