$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
まず、細菌の16S rRNA特異的蛍光原位ハイブリダイゼーション(FISH)プローブを含む溶液を、細菌が定着したマウス腸切片を含むスライドに加えます。
カバースリップを敷いて、プローブを含む液体を広げて蒸発を防ぎます。
スライドを加湿チャンバーで高温で孵化させます。
これによりRNAの二次構造が展開され、細菌の16S rRNA内の補完配列とのプローブのハイブリダイゼーションが促進されます。
カバースリップを外し、温めた洗浄バッファーでキュベートして、未結合プローブを除去します。
リン酸バッファーでうすぎて生理的なpHを維持します。
粘液特異性染料と核染料を含むカウンターステインを塗布し、培養します。
これらの染料は腸内粘液や細菌および宿主細胞のDNAに選択的に結合します。スライドをバッファーで洗い、マウントカバースリップをマウントメディアでスライドに取り付けます。
共焦点顕微鏡で、切片内のFISH標識細菌、腸内細胞、粘液層を観察します。
各組織切片の周りに液体ブロッカーやPAPペンを使って非常に密接な円を作り、ハイブリダイゼーション溶液でカバーする膨張面積を制限し、インクとの接触を防ぎます。
ハイブリダイゼーション溶液を準備し、使用した溶液50マイクロリットルごとに0.5マイクログラムのプローブを加えます。溶液をスライドのセクションにピペットで塗り付けます。セクションに柔軟なプラスチックカバースリップを重ねて、使用する液体の量がセクション全体を覆うようにしてください。
過剰なハイブリダイゼーション溶液やPBSで湿気を与えたワイプやペーパータオルをピペットチップボックスで湿らせたチャンバーを作り、湿度を保ちます。蒸発を抑制するプローブの設定に応じて、湿度の高いチャンバーで少なくとも3時間、湿度の高いチャンバーでキュベーションします。プラスチックのカバースリップを取り出し、FISH洗浄バッファーの中、コプリンの瓶に入れて50度まで温めてキュベーションします。
コプリンの瓶を50度のオーブンに戻し、10〜20分加熱します。FISH洗浄バッファーを取り出し、Coplinの瓶のPBSに交換してください。コプリンの瓶にPBSを補充した後、すぐにPBSをデカントします。
スライドを瓶から取り出し、カウンターステインをセクション全体の上にピペットで塗り、ピペットの先端で組織に触れないように注意してください。4度Cで45分間孵化します。シミは新鮮なPBSで素早く3回洗い流します。
スライドの裏側をワイプやペーパータオルで拭き、ピペットチップに接続された真空ラインでほとんどのPBSが蒸発するのを待ちます。セクションは取り付け媒体を使って取り付けます。カバースリップをスライドに取り付ける際は、カバースリップの縁に沿って透明なネイルポリッシュを塗り、スライドの端から離れるように注意してください。常温で固めます。