マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

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まず、細菌の16S rRNA特異的蛍光原位ハイブリダイゼーション(FISH)プローブを含む溶液を、細菌が定着したマウス腸切片を含むスライドに加えます。

カバースリップを敷いて、プローブを含む液体を広げて蒸発を防ぎます。

スライドを加湿チャンバーで高温で孵化させます。

これによりRNAの二次構造が展開され、細菌の16S rRNA内の補完配列とのプローブのハイブリダイゼーションが促進されます。

カバースリップを外し、温めた洗浄バッファーでキュベートして、未結合プローブを除去します。

リン酸バッファーでうすぎて生理的なpHを維持します。

粘液特異性染料と核染料を含むカウンターステインを塗布し、培養します。

これらの染料は腸内粘液や細菌および宿主細胞のDNAに選択的に結合します。スライドをバッファーで洗い、マウントカバースリップをマウントメディアでスライドに取り付けます。

共焦点顕微鏡で、切片内のFISH標識細菌、腸内細胞、粘液層を観察します。

各組織切片の周りに液体ブロッカーやPAPペンを使って非常に密接な円を作り、ハイブリダイゼーション溶液でカバーする膨張面積を制限し、インクとの接触を防ぎます。

ハイブリダイゼーション溶液を準備し、使用した溶液50マイクロリットルごとに0.5マイクログラムのプローブを加えます。溶液をスライドのセクションにピペットで塗り付けます。セクションに柔軟なプラスチックカバースリップを重ねて、使用する液体の量がセクション全体を覆うようにしてください。

過剰なハイブリダイゼーション溶液やPBSで湿気を与えたワイプやペーパータオルをピペットチップボックスで湿らせたチャンバーを作り、湿度を保ちます。蒸発を抑制するプローブの設定に応じて、湿度の高いチャンバーで少なくとも3時間、湿度の高いチャンバーでキュベーションします。プラスチックのカバースリップを取り出し、FISH洗浄バッファーの中、コプリンの瓶に入れて50度まで温めてキュベーションします。

コプリンの瓶を50度のオーブンに戻し、10〜20分加熱します。FISH洗浄バッファーを取り出し、Coplinの瓶のPBSに交換してください。コプリンの瓶にPBSを補充した後、すぐにPBSをデカントします。

スライドを瓶から取り出し、カウンターステインをセクション全体の上にピペットで塗り、ピペットの先端で組織に触れないように注意してください。4度Cで45分間孵化します。シミは新鮮なPBSで素早く3回洗い流します。

スライドの裏側をワイプやペーパータオルで拭き、ピペットチップに接続された真空ラインでほとんどのPBSが蒸発するのを待ちます。セクションは取り付け媒体を使って取り付けます。カバースリップをスライドに取り付ける際は、カバースリップの縁に沿って透明なネイルポリッシュを塗り、スライドの端から離れるように注意してください。常温で固めます。

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最終更新:15 8月 2026