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まずはレ ギオネラ肺炎菌の培養から始めます。これは外膜小胞を放出する病原性グラム陰性菌です。
これらのOMVはリポ多糖類や膜タンパク質を運び、細菌の病原性に寄与します。
培養液を遠心分離して、細菌を無傷のままペレットします。
OMVを含む上清液を回収し、再び遠心分離機で残留細菌を除去します。
上清液を膜を通して残った細菌を除去しつつ、OMVを保持します。
新しい膜を使って細菌の残骸を除去するために2回目のろ過を行います。
細菌のいないろ過液を集め、超遠心分離機でOMVをペレット化します。
上清液を捨て、ペレットをバッファーに再懸浮させ、再び超遠心分離機で緩く結合したタンパク質やリポ多糖を除去します。
上清液を取り除き、精製済みOMVをバッファーに再懸濁させます。
OMVのアリコートを血液寒天とBCYE寒天プレートにストレートし、培養します。
コロニー形成がないことは、細菌による汚染がないことを裏付けています。
OMVsは宿主と病原体相互作用の研究のために低温で保存してください。
残りの液体培養液を90ミリリットルの新鮮YEB培地に加え、回転シェイカーで培養し、OD600(3.0〜3.5)に達するまで培養します。液体培養液を4,000gで20分間遠心分離し、細菌をペレットで除去します。その後、上清液を新しい遠心分離機チューブに移します。
細菌ペレットを廃棄し、再び遠心分離してから、再び遠心分離を繰り返します。次に、残った上清液を2回フィルターで滅菌します。
その後、細菌のない上清液を超遠心分離機管に移し、サンプルを100,000gで4度Cで3時間回転させます。上清液をデカントして捨てます。その後、滅菌PBSでOMVペレットを再懸浮させてプールします。
超遠心分離の手順を繰り返して、汚染タンパク質と遊離LPSを除去します。次に、上澄液を捨て、超遠心分離機チューブを滅菌綿棒で乾燥させます。OMVペレットを500マイクロリットルの滅菌PBSで再懸浮させます。
次に、血液寒天とBCYE寒天プレートにそれぞれ20マイクロリットルのストリークを施し、準備済み小胞の細菌汚染を排除します。血液寒天培地を一晩、BCYE寒天培地を3日間培養します。