細菌感染マウス脳における標的遺伝子発現の検出

病原性細菌に感染したマウスの脳から抽出された総RNAを例に取る。抽出物には感染応答性遺伝子からの転写が含まれています。

DNA分解酵素を加え、残留ゲノムDNAを分解するためにインキュベートします。

逆転写酵素(RT)酵素、ヌクレオチド、非特異的プライマーを含むマスターミックスを追加します。

インキュベートして補完的なDNA(cDNA)を合成します。

高温でRT酵素を不活性化します。

DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、二本鎖DNA結合染料、標的遺伝子に特異的なプライマーを含むマスターミックスを考えます。

cDNAを加え、加熱を加えてDNAを変性させます。

プライマーは標的のcDNAに結合し、新たなDNA鎖の合成を可能にします。

このサイクルは標的遺伝子を増幅するために繰り返されます。

この染料は増幅されたDNAに結合し、蛍光を放出し、各サイクルの終わりに記録されます。

蛍光の増加は感染マウス脳における感染応答性遺伝子の発現を確認させます。

プランクトニック細胞またはバイオフィルム状態細胞ですべてのマウスに感染し、テキストプロトコルに記載された安楽死を行います。次に、RNA抽出キットを使って脳組織から全RNAを抽出します。

各マウスごとに脳全体を使い、RNAを抽出します。脳組織全体を5本の管に分けます。最大100ミリグラムの脳組織を取り、キットに付属する溶解マトリックスを含む各チューブに1ミリリットルの溶解液を加えます。

テキストプロトコルに記載された手順に従ってRNAを抽出します。次に、逆転写試薬キットを備えたサーモサイクラーを用いて、ゲノムDNAの除去を含むcDNA合成を行います。5倍ゲノムDNA脱離バッファー2マイクロリットルとゲノムDNA脱離酵素1マイクロリットルを含むチューブに1マイクログラムのRNAを加えます。

RNaseフリーの水を10マイクロリットルまで加えます。42度で2分間孵育します。反応液にマスターミックス10マイクロリットルを加え、優しく混ぜます。

直ちに逆転写反応を行い、チューブを37度の温度で15分間置いてください。次に反応を85度に5秒間移します。リアルタイムPCR機器とサイバー定量リアルタイムPCRキットを用いて定量的リアルタイムPCR解析を行います。キットの説明に従って、酵素、プライマー、50x ROXリファレンス染料2、cDNAテンプレートを組み合わせます。次にRNaseフリーの水を加え、合計20マイクロリットルに達するまで加えます。

各サンプルをテキストプロトコルに記載された熱パラメータで三重に処理し、2マイナスデルタのCT法に基づいて相対折りたたみ変化を計算します。