植物RNAサイレンシングを抑制する病原体エフェクターのスクリーニングのための共浸透アッセイ

同じ体積で、GFPをコードするプラスミド1とエフェクタータンパク質をコードするプラスミド1をそれぞれ持つ2つの Agrobacterium tumefaciens 懸浮液の混合物を用意します。

穴を開けて、針なし注射器で健康で完全に膨張した ニコチアナ・ベンタミアナ 16cの葉の下表面に混合液を浸透させます。

過剰な懸浮液は軟部組織で擦り取って細菌の過剰増殖を防ぎます。

浸透した場所に印をつけ、最適な成長条件で育ててください。

アグロバクテリウム はプラスミドDNAを植物細胞に転送し、GFP遺伝子とエフェクター遺伝子はmRNAに転写され、タンパク質に翻訳されます。

プラントの防衛システムはRNAサイレンシングを用いており、二重のsiRNAをRISCにロードします。パッセンジャーストランドは除去され、ガイドストランドが複合体に標的GFP mRNAを分解させるよう指示します。

しかし、エフェクタータンパク質はsiRNAに結合し、RISCとの結合を防ぎGFP蛍光を持続させます。

これにより、植物のRNAサイレンシングを抑制する病原体効果因子の同定が可能になります。

35S緑色蛍光タンパク質を含むアグロバクテリウム培養液と、35Sキュウリモザイクウイルス抑制子2bを含むアグロバクテリウム培養液、推定効果子、または空のベクターを等量混合します。1ミリリットルの針なし注射器を使い、ニコチアナ・ベタミアナ16cの葉の背面側にある混合アグロバクテリウム懸濁液を慎重にゆっくり浸透させます。

葉に残った細菌の懸浮液を軟部組織の拭き取りで取り除き、浸潤した斑点の縁をマーカーペンで円を描きます。