新生マウス脾臓食細胞による細菌死のin vitro評価

まず、新生マウスの脾臓を機械的に解離させて単細胞懸濁液を生成することから始めます。

懸濁液をチューブに移し、遠心分離機で上清液を除去します。

ペレットをリシスバッファーに再懸浮させて赤血球を除去します。

バッファーを加え、再度遠心分離機で外して上清液を取り除きます。

細胞をバッファーに再懸浮させ、好中球や炎症性単球に発現する受容体を標的とした抗体被覆磁気マイクロビーズでインキュベートします。

遠心分離機で包み出したビーズを取り除きます。バッファーを追加し、懸濁液を強磁性カラムに通し、ビーズに結合されたセルを保持するために磁場を加えます。

磁場を取り除き、バッファーで細胞を洗い出し、マルチウェルプレートにシードします。

選定された井戸に発光バクテリアの濃度を増やします。

好中球や単球が貪食によって細菌を内部化できるようにインキュベートします。

抗生物質を含む培地に置き換えて、内部化していない細菌を除去します。

細菌の体内化とその後の食細胞作用による殺菌を評価するために、一定間隔で発光を記録します。

in vitro細菌殺菌アッセイを行うには、未感染の脾臓を40マイクロメートルのナイロンストレーナーに入れ、5ミリリットルのPBSを10%胎児用牛血清を補足した無菌60ミリメートルのペトリ皿内に置き、無菌の3ミリリットルシリンジプランジャーで組織を単一細胞懸浮液に分解します。細胞を15ミリリットルの遠心分離機チューブに移し、遠心分離で採取します。ペレットを3〜4個の脾臓ごとに1ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸浮させます。

室温で5分後、脾臓をPBSで洗浄し、ペレットを250マイクロリットルのPBSに牛血清アルブミンと2ミリモラーEDTAを補足して再懸浮させてカウントします。次に、製造元のプロトコルに従い適切な免疫磁気ビーズでLy6 B2陽性細胞を分離し、濃縮されたLy6 B2陽性細胞を、黒または白の96ウェルプレートで1×100マイクロリットルのウェル密度あたり100マイクロリットあたり5細胞のシードを行います。細菌接種物を1ウェルあたり100マイクロリットルの最終体積で所望の感染倍数で準備し、各ウェルに100マイクロリットルの細菌接種または培地を単独で添加して、細胞培養インキュベーター内で1時間の培養を行います。

培養終了時に培地を200マイクロリットルの新鮮な完全培地に置き換え、さらに1ミリリットルあたり100マイクログラムのゲンタミシンを補足して残った細胞外細菌を除去し、細胞をさらに2時間細胞培養インキュベーターに戻します。インキュベーション終了後およびその後の各実験時点で、プレートリーダーを使って蓋付き培養プレートの各ウェルの発光を測定し、次の測定値までプレートを細胞培養インキュベーターに戻します。