マウスの歯肉組織切片における細菌の現場検出

病原菌に感染し、細菌DNAにアクセスするために前処理されたマウスの歯肉切開を取る。

細菌DNAを標的としたジゴキシゲニン標識DNAプローブをバッファーに適用します。

サンプルの脱水を防ぐためにカバースリップを貼り、密封してください。

加熱を加えてDNAを変性させ、その後高温で湿った環境でインキュベーションしてプローブのハイブリダイゼーションを可能にします。

スライドを冷やしてカバースリップを外し、バッファーで何度も洗浄して、未結合のプローブを取り除きます。

非特異的抗体結合を防ぐブロッキング溶液を加えます。

ジゴキシゲニンに結合する酵素共役抗体でインキュベートします。

結合していない抗体を除去するために洗いましょう。

内因性酵素を選択的に不活化する阻害剤を加えます。

酵素と反応する基質を塗布して色付きの沈殿液を作ります。

余分な基材を落とすために水ですすいでください。

染料を加えて核を染めます。

余分な染料を落とすために洗いましょう。

エタノールで脱水し、キシレンで処理して組織の透明度を高めます。

セクションを取り付けろ。

顕微鏡で切片内の細菌を観察してください。

まずはスライドを2xのSSCに20分間浸してインシスタを始めます。その間に、標書プローブをハイブリダイゼーションバッファーで1ナノグラム/マイクロリットルに希釈します。陰性コントロールの場合は、標識のないプローブの濃度を10倍にします。その後、プローブを90度Cで10分間加熱し、その後氷上で素早く冷却して変性させます。

次に、プロテイナーゼKと同じ量のプローブ希釈を各スライドに適用します。その後、スリップ&シール部分をネイルポリッシュで丁寧に覆います。次に、PCRマシンのブロックでスライドを90度Cで10分間加熱し、45度の加湿インキュベーターに一晩移します。

翌日、スライドを4度Cで30分ほど冷やし、その後慎重にカバースリップを外します。組織は脆い。最後に、スライドを室温の一連のSSCバッファーに通します。

現場でハイブリッドスライドをMABTで5分間洗います。次に、ブロッキング液50〜400マイクロリットルを1%のトゥイーン20に20分間塗布します。ブロック培養後、1〜1000の抗DIGアルカリリンホスファターゼ抗体をブロッキング溶液中に50〜400マイクロリットルに塗布します。

37度の温度で90分間結合させます。プライマリー塗布が終わったら、スライドをMABTで10分間洗います。その後、5分間スライドを1%のTween 20入り検出バッファに入れます。

次に、各スライドに1ミリモラールレバミゾール検出バッファー溶液を50〜400マイクロリットル塗布し、5分間インキュベークして内因性アルカリ性ホスファターゼを不活性化します。次に、各スライドに検出バッファーで希釈したNBT/BCIPを50〜400マイクロリットル追加し、経験に基づいて加湿チャンバーで2〜3時間培養します。

スライドはDI水で洗い流してください。次に、体積比0.05%のメチルグリーンを塗り、37度の環境で10分間カウンターステインを組織に塗ります。スライドを再びDI水で洗い、その後100%エタノールで脱水し、その後キシレンに浸します。最後に、80マイクロリットルのマウントメディアを塗布し、スライドを覆い隠します。