植物細胞への遺伝子送達のための アグロバクテリウム 培養の調製

まず、汚染防止とプラスミド保持を確保するために、抗生物質2種類の補佐を加えた培地で培養した アグロバクテリウム・トゥメファシエン ス培養から始めます。

細菌には、関心遺伝子と抗生物質耐性遺伝子を持つ植物発現ベクターが含まれています。

また、目的の遺伝子を植物細胞に届けるために必要な病原性遺伝子領域を持つヘルパープラスミドも含んでいます。

一部を緩衝培地に移し、植物由来のシグナル分子であるアセトシリンゴンと抗生物質を補完します。振って孵化させてください。

アセトシリンゴンは細胞内に拡散し、シグナル伝達経路を誘導し、関心遺伝子の移転に必要な病原性遺伝子の発現を活性化します。

培養液を移し、遠心分離機で細菌を採取し、上清液を廃棄します。

塩の緩衝剤を加え、細胞を繰り返し洗浄して添加された抗生物質を除去します。

細菌をアセトシリンゴンでバッファー内に再懸浮させ、振らずに培養して病原性遺伝子発現を維持します。

効率的な変革のために、すぐに文化を活用しましょう。

先端を使ってLBプレートから陽性のコロニーを取り出し、細胞を5ミリリットルのLB培地に50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンと50マイクログラム/ミリリットルのリファンピシンを補足したガラス管に接種します。細胞を30度の温度で200回転/分で振って24〜48時間培養します。

培養液100マイクロリットルを、同じ抗生物質、pH5.6の10ミリモラMES、20マイクロモルASを補足したLB培地5ミリリットルに移す。細菌は30度で培養し、200回転で振って16〜20時間培養します。細胞を4,000 倍g で10分間遠心分離します。上清液を捨て、ペレットを10ミリモラ塩化マグネシウムバッファー2ミリリットルに再懸浮させます。

抗生物質を完全に除去するために洗浄を繰り返します。ア グロバクテリウム 培養物の密度を600ナノメートルで測定して測定します。細胞培養を10ミリモラの塩化マグネシウムバッファーで、OD₆₀₀ の1.5から2.0に調整します。

最終懸濁培養液にpH5.6のMES10ミリモラーと150マイクロモルASを加え、室温で少なくとも3時間振動せずに培養します。