蛍光標識細菌における染色体分離のタイムラプスイメージング

まず、蛍光タグ付けされた染色体起源を発現する細菌や蛍光微小球を含む、金属フレームに栄養豊富なアガロースパッドを置きます。

アガロースパッドは細菌の付着と移動を支え、蛍光マイクロスフィアは染色体分離の追跡基準として機能します。

逆置広角顕微鏡の予熱されたインキュベーションチャンバーで対物レンズに浸漬油を加えます。

サンプルをレンズの上に置き、複数の細菌と少なくとも1つの蛍光微小球がある領域に焦点を合わせます。

タイムラプスイメージングを開始し、位相差画像と蛍光画像の両方を撮影します。

蛍光タグ付き複製起点は細胞の一端近くに明るいクラスターとして現れます。

分割の際には起源が重複します。一方のクラスターは元の端に残り、もう一方のクラスターは新たに形成された細胞端へ移動します。

この構成により、複数の分裂にわたる染色体分離の追跡が可能となり、宿主間相互作用中の病原性を含む他の細菌の類似の動的プロセスを可視化するために適応可能です。

タイムラプス顕微鏡を実施するには、顕微鏡の電源を入れて顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。正しい対物レンズと鏡、フィルターを選択して位相差画像だけでなく、緑蛍光、赤蛍光、黄色蛍光タンパク質の画像を取得します。高品質の浸漬油をレンズのレンズと、32度摂氏で事前に培養したサンプルの底に1滴加えます。

穴の側を対物鏡に向けて、金属フレームを顕微鏡ステージに置き、サンプルをステージホルダーにしっかりと固定します。ステージをZ方向に目標物に近づけてセルに集中します。対物レンズと試料の油が接触したら、ステージをX/Y方向に動かします。

Metamorphソフトウェアに切り替えて取得ツールを開きます。設定ドロップダウンリストで位相コントラストを選択し、露光時間を100ミリ秒に設定します。「ライブ表示」をクリックし、セルを焦点面に取り込み、X方向/Y方向にステージを移動して、視野に複数の単一セルが見えるまで移動します。

後で取得した画像を照準するために、少なくとも1つの蛍光微小球が視野領域にあることを確認してください。次に、顕微鏡制御ソフトの多次元取得ウィザードを開き、必要に応じて複数の波長や段位置で画像を取得するタイムラプス実験を設定します。

メインタブでタイムラプスとマルチプルウェーブレンズを有効にしてください。追加のタブはウィンドウの左側に表示されます。「保存」タブをクリックし、「ディレクトリ」を選択して、取得した画像を保存するためにコンピュータのハードドライブの空のフォルダを選択し、次に「ファイルが存在するならインクリメントベース名」を有効にして、連続したデータセットが以前のデータセットを上書きしないようにしてください。実験名に日付と品種名またはタイトルを付けます。

タイムラプスタブをクリックしてタイムラプスのパラメータを調整し、タイムインターバルを20分に、持続時間を24時間に設定してください。時間点の数は自動的に変わります。さて、波長タブをクリックしてください。

各画像の取得波長数を、各時刻で変えて取得する波長数を選択します。各波長ごとにハードウェアの記憶AF位置を許可する。上部から「First Wavelength」タブをクリックしてください。

照明ドロップダウンリストで位相コントラストを選択します。露出のために100ミリ秒を選択し、取得ドロップダウンリストで「Every Time Point」を選択します。ドロップダウンリストで「なし」を選択して自動公開を無効にし、ドロップダウンリストの「すべての取得」で「オートフォーカス」を選択してください。

以下のパラメータを使って、先ほど示したようにすべての波長で露出を設定します。その後、複数のステージ位置から画像を取得するには、メインタブで「マルチプルステージポジション」を有効にしてください。ステージタブをクリックし、ライブボタンをクリックすると視野を確認できます。

ステージをX方向やY方向に動かし、ROIが視野に入るまで進めます。ステージタブのX座標とY座標はプラス記号をクリックして保存してください。新しいROIが見つかるまでステージをX/Y方向に再度移動させ、プラス記号をクリックして座標を再度保存します。

希望するリージョン数が保存されるまで続けてください。保存したX位置とY位置をクリックしてセルがピント合っているか再度確認し、実験中保存したZ位置を一定に保つためにAFCホールドをクリックしてハードウェアのオートフォーカスを開始します。顕微鏡制御ソフトの多次元取得ウィザードでタイムラプス記録を開始するには、取得をクリックしてください。

タイムラプス録画の最初の数点以降もセルがピントが合っているか確認し、画像の品質を最大化し、必要に応じて再フォーカスしてください。