Bdellovibrio bacteriovorusのライブ細胞タイムラプス画像診断 大腸菌に対する捕食

まず、捕食性細菌である Bdellovibrio bacteriovorusとその獲物である E. coliを共培養したペトリ皿を、アガロースパッドの下に置きます。

アガロースパッドは 大腸菌 を動けなくし、B . bacteriovorus は運動性を保ち、獲物細胞に積極的に侵入します。

捕食者は赤色の細胞質マーカーと緑色の蛍光タグをDNAポリメラーゼサブユニットに融合させて可視化します。

皿をホルダーに固定し、最適な分解能を得るために皿の底と顕微鏡対物に浸漬油を塗布します。

ホルダーを顕微鏡に取り付け、デュアルチャネル蛍光検出に設定します。

明視野光学を用いて焦点面を特定し、複数の重なりのないイメージングフィールドを選択します。

タイムラプスパラメータを設定し、定められた間隔で明視野画像と蛍光画像の両方を順次撮影します。

この方法は、獲物の付着と侵入から始まり、その後の被食細胞変換、糸状成長、分離、子孫形成、そして最終的に獲物細胞溶解を目指す捕食の観察を可能にします。

共培養のタイムラプス蛍光顕微鏡では、皿をペトリ皿ホルダーに入れ、実験中に皿が動かないようにし、逆さまの対物鏡に1滴の浸漬油を、皿の底に1滴を置きます。ホルダーを逆さ顕微鏡チャンバー内の顕微鏡ステージに取り付け、顕微鏡ソフトウェアで倍率を100倍、多色レンズをGFPとmCherryに設定します。Brightfieldの接眼レンズを使って焦点面を特定し、ポイントリストマネージャーを開きます。

ステージを移動させ、ポイントの マーク ボタンを使って少なくとも10の位置の座標を保存してください。カメラのバルブを接眼レンズからモニターに切り替えてください。焦点面を設定し、ポイントリストマネージャーの 「Replace Point 」ボタンをクリックして各点をキャリブレーションします。

実験設計者を開いて、病気積み重ね箱のマークを外してください。適切な蛍光チャンネルと最適な照明設定を選択し、画像取得と実験の総時間の間の間隔を設定します。選択した位置のフォーカス維持を有効にし、画像ファイルを自動保存するデータフォルダを選択します。

顕微鏡ソフトのコントロールで全ての設定を再確認し、タイムラプス実験を開始してください。実験の最初の1時間が終わったら、すべてのステージ位置がピントが合っているか確認してください。タイムラプス実験が終了したら、ペトリ皿を取り出し、適切なバイオセーフティプロトコルに従って35ミリの皿をアガロースパッドとともに廃棄します。