蛍光イメージングによる細菌タンパク質分布の三次元可視化

まず、細胞質の赤色蛍光マーカーとタンパク質特異的な緑色蛍光マーカーで標識された細菌細胞を含む密閉スライドから始めます。

蛍光顕微鏡でスライドを観察してください。

十分に分離された細菌細胞があるフィールドを見つけ、代表的な細胞の中心に注目します。

最初の蛍光チャネルを設定し、代表セルとその近傍セルの三次元形状を捉えるために特定のパラメータでzスタック画像を取得します。

次に、2番目の蛍光チャネルに切り替え、同じパラメータを持つ同じセルの別のzスタック画像を取得します。

細胞内の細菌タンパク質の分布を捉えます。

各zスタックから個々のセルをトリミングし、単一細胞解析のために分離します。

これらの画像を整合させて、細菌タンパク質の細胞形状に対する分布を可視化し、宿主と病原体の相互作用における正確な解析を可能にします。

カバースリップを密封した直後、スライドを顕微鏡ステージに置き、5分間の熱平衡の後、顕微鏡のフォーカスホイールを使ってセルの中央をピント合わせします。ND取得の関連顕微鏡ソフトウェアでZボックスにチェックを入れてZスタックを取得し、Homeボタンをクリックしてセルの中央をスタートポイントに設定してください。ステップサイズを0.1マイクロメートル、レンジを4マイクロメートルに設定し、Zデバイスはピエゾステージに設定されていることを確認してください。

セルの上下両方に十分なぼやけがあり、セルが背景とほとんど区別がつかないほどであることが非常に重要です。ラムダウィンドウの蛍光チャンネルを画像化する蛍光分子の設定に設定し、実験の順序がラムダに設定されていることを確認し、切り替え前に各カラーチャンネルで完全なZスタックが得られることを確認します。次に「今すぐ実行」をクリックして画像取得を開始します。

すべての画像を取得したら、適切な画像解析ソフトでファイルを開きます。個々のセルの周りにボックスを描き、そのセルを2回複製します。各チャネルごとに1回ずつ、重複ハイパースタックボックスにチェックを入れてから、チャネルを1または2に変更します。両方のスタックが利用可能になったら、「画像」「スタック」「ツール」「コンカテネート」を選択して画像を組み合わせます。