マウス共感染モデルにおける細菌列挙のための感染組織処理

まずは病原性細菌とウイルスに共感染したマウスから始めます。

このウイルスはマウスの上気道の上皮膜を損傷し、鼻咽頭から肺への細菌の拡散を促進します。

採取したマウスの肺をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)入った皿に入れます。

肺を小さく刻んでよく混ぜます。

肺組織の半分をPBS入りチューブに移します。

肺組織を収めたチューブ内に滅菌された組織均質プローブを入れます。

組織を均質化して細菌をPBSに放出します。

均質液を希釈し、希釈物を栄養豊富な寒天プレートにプレートします。

培養皿を培養して細菌コロニーが形成されます。

これらのコロニーを数えて肺の細菌負荷を定量化し、これは肺の細菌負荷を反映します。

肺採取では、解剖ハサミを使って露出した肋骨の側面を切り、肋骨をマウスの頭部に向かって優しく引き上げて心臓を露出させます。25ゲージの針を10ミリリットルのPBS充填シリンジに接続し、右心室に挿入し、ゆっくりと灌注を始めます。肺の漂白が成功しているかどうかを確認してください。

肺組織を壊さないようにゆっくりと流してください。鉗子で心臓を持ち上げ、肺と心臓を分けるために切開します。分離後は、鉗子で肺のすべての葉を採取し、滅菌PBSで皿で残留血液を除去します。

ペトリ皿で肺を小さく刻み、よく混ぜます。肺混合物の半分を取り除き、細菌のCFU(ウイルス性PFU)を特定し、0.5ミリリットルのPBSを充填した丸底の15ミリリットルチューブに入れて均質化します。

採取した組織を均質化するには、ホモジナイザープローブを70%エタノールに浸し、60%の出力で30秒間ホモジナイザーをオンにして洗浄します。この工程を無菌水で10秒間繰り返します。

各組織を1分間均質化します。細菌数の列挙については、血液寒天プレートの連続希釈プレートを用いてください。総CFUを計算するには、10マイクロリットルでメッキし、各サンプルの最終体積をミリリットルで記録します。37度C、5%の二酸化炭素で一晩培養します。