ポリメラーゼ連鎖反応を用いた二元培養における糖類細菌の検出

まずは糖球菌感染の アクチノマイセス 培養から始めます。

超小型寄生細菌である糖類細菌とその宿主は二元培養を形成します。

感染した培養物のアリコートを、電気泳動追跡染料と糖類特異的プライマーを含む増幅試薬を含むPCRチューブに加えます。

チューブをPCR条件を決めたサーモサイクラーに入れます。

初期変性の際に熱で糖類菌を溶解し、ゲノムDNAを放出します。 アクチノマイセは 硬い細胞壁により宿主DNAの放出が制限されるため、そのまま残っています。

熱によって糖類のDNA鎖が変性し、タックポリメラーゼが活性化されます。

アニーリング中、プライマーは糖類細菌ゲノム内の補完配列に結合します。

さらに、TaqポリメラーゼはプライマーにdNTPを加え、新しいDNA鎖を合成します。

増幅されたPCR産物を、DNA断片に結合する染料であらかじめ染色されたアガロースゲルに積み込みます。

電気泳動を行い、UV光の下でゲルを観察してください。

糖類細菌特異的なアンプリコンバンドは、二元培養における宿主–寄生虫の相互作用を確認します。

PCRマスターミックス24マイクロリットルを0.2ミリリットルのPCRチューブにアリコートします。1マイクロリットルの糖類菌感染培養液にチューブを入れ、サーモサイクラーに入れます。

PCRプログラムをテキスト原稿に記載した通りに設定してください。PCR産物を1%のアグロスゲルにロードして走らせます。約600塩基のバンドが糖球菌の存在を確認できます。