感染した宿主細胞からの細胞内病原性細菌の単離

病原性細菌の懸濁液を取ってください。

懸留液を骨髄由来のマクロファージまたはBMDM細胞の接着培養に加え、培養します。

細菌は表面タンパク質を使って宿主細胞受容体に結合し、接着を促進します。

粘着していない細菌を除去するためにバッファーですすぎます。

新しい培地を加えて培養します。

接着した細菌は宿主細胞に内部化されます。

抗生物質を追加して体内化していない細菌を殺します。

メディアは捨ててバッファーで洗います。

冷たい水を加えて宿主細胞を溶解し、細胞内容物、核、体内化された細菌を放出します。

細胞溶解液を回収し、遠心分離機で細胞の残骸を沈殿させます。

細菌を含む上澄液を採取してください。ろ過装置を通して、無傷の細菌を捕獲します。

ろ紙を折りたたんでチューブに入れます。

細胞の完全性を保つために液体窒素で急凍します。

冷蔵保存して、さらに使用してください。

洗浄された細菌懸濁液の0.5ミリリットルを使い、各マクロファージプレートに感染させます。複数のプレートを使用する場合は、感染間隔を15分空けて、感染終了時にそれぞれのプレートを個別に採取できるようにしてください。37度で30分間の培養後、PBSを使って感染細胞を2回洗浄し、未付着の細菌を除去し、その後30ミリリットルの予備温めたBMDM培地を加えます。

細菌が体内化するのを待つために30分間潜伏させてください。感染後1時間後にゲンタミシンを最終濃度50マイクログラム/ミリリットルに加え、残存する細胞外細菌を殺します。フィルター装置は、真空出口ポート付きの液体フラスコにフィルターヘッドを取り付けて組み立てます。

次にフィルターヘッドに0.45マイクロンのフィルターを置き、シリンダーのじょうごを置き、金属製のクランプで各部品を固定します。感染後6時間後、採取前に顕微鏡で細胞単層を観察してください。一度に一つのプレートで細菌を採取し、PBSを使って感染した細胞を洗浄します。

次に、マクロファージ細胞を溶かすために、氷のように冷たいRNAseフリー水を20ミリリットル加え、素早く慎重に細胞スクレーパーで細胞をプレートからこそげ落とします。細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに集めた後、30秒間渦を流し、その後800 倍g 、4度の遠心分離機で3分間マクロファージ細胞核を除去します。細菌を集めるには、真空システムを使ってフィルターを通して上清液を通します。

その後、ピンセットでフィルターを巻き、素早く15ミリリットルの円錐形チューブに移します。すぐに液体窒素を使ってチューブをスナップフリーズしてください。