感染マウスマクロファージから採取した リステリア・モノサイトゲネス からのRNA抽出

リステリア・モノサイトゲネスを含むフィルターペーパーを用意してください。これらの細菌は感染したマウスのマクロファージから採取されます。

RNase阻害剤を含むバッファーを追加してRNA分解を防ぎ、チューブを複数の角度で渦巻きて細菌を押し出します。

遠心分離機で懸濁液をフェノール・クロロホルム・洗剤混合物が入ったチューブに移します。

ボルテックスして高温で培養し、細菌の膜を破壊し、タンパク質を不活化させ、細菌を溶解して細胞内成分を放出します。

遠心分離機でRNA豊富な水相を他の成分から分離します。

RNAを採取し、酢酸ナトリウムとエタノールを含むチューブに移します。

渦を巻き込み、低温で孵化します。

酢酸ナトリウムはRNAの負電荷を中和し、一方でエタノールや低温環境はRNAの沈殿を促進します。

遠心分離機でRNAをペレット化します。

上澄液を取り除き、冷たいエタノールでペレットを洗います。

再び遠心分離機で上清液を取り除き、自然乾燥させてRNaseフリーの水を加えます。

RNAを保存してさらなる解析を行ってください。

フィルターを冷やすために氷の上でチューブを解凍してください。次に各チューブに650マイクロリットルの冷たい酢酸EDTAまたはAEバッファーを加えます。

できるだけ素早く作業し、フィルターチューブを激しく渦巻かせてフィルターがチューブの周辺に回り、バッファーがフィルターを完全に洗浄します。フィルターから細菌を完全に洗い流すには、チューブとボルテックスを逆さまにする必要があるかもしれません。この手順で最も重要なステップは、細菌を効率的にフィルターから除去することです。

そのために、チューブを異なる位置で何度も回転させます。残りのサンプルがヴォルテックスされたら、短くチューブを回転させてください。次に、各チューブからSDSおよびフェノールクロロホルムのチューブに細菌を含むバッファーを移した後、チューブを多管の渦装置に入れ、10分間全速力で渦を流します。

その後、65度の加熱ブロックで10分間培養し、最大速度で5分間回転させます。水層を3モル酢酸ナトリウム40マイクロリットルと1ミリリットルの100%エタノールを含む新しいチューブに移します。サンプルを徹底的に渦巻かせた後、チューブをマイナス80度の温度で1時間、またはマイナス20度の温度で一晩培養します。

その後、サンプルを遠心分離した後、各チューブから慎重にエタノールを吸引し、それぞれのサンプルに冷たい70%エタノールを500マイクロリットル加えます。サンプルを旋回させて再度回転させた後、各チューブからエタノールを慎重に吸引し、真空蒸発器でペレットを2分間乾燥させます。次に、各チューブにRNAseフリー水25マイクロリットルを加え、室温で20分間培養します。