タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

本手順では、SARS-CoV RBDタンパク質を発現する組換えワクチンを調製し、SARS擬似ウイルスに対する中和活性を誘導する能力を評価します。まず、トランスフェクションした293T細胞の培養上清からRBDタンパク質を精製・発現させます。次いで、この精製タンパク質を用いて免疫を行います。

免疫血清の中和能を定量化するため、免疫後のさまざまな時点でワクチン接種マウスからマウスおよび血清を採取します。擬似ウイルス中和アッセイを実施し、組換え手法で作製したルシフェラーゼ発現SARS擬似ウイルスを、段階希釈したマウス血清とともにインキュベートします。次に、中和されたこれらのウイルスがSARS共受容体ACE発現細胞に感染する能力を、感染細胞における相対的なルシフェラーゼ活性を測定することで評価します。

これにより、50%中和抗体価を算出することができます。私はtuです。現在は研究室のポスドクとして勤務しています。

生ウイルスを用いた中和試験などの既存の手法に対する擬似ウイルス中和試験の主な利点は、この手法が比較的安全であることです。感染性のあるSARSウイルスを必要とせず、バイオセーフティレベル3（BSL-3）以外の研究室で実施可能です。本手順の実演を担当するのは、私の研究室のポストドクトラルフェローであり、SARSやインフルエンザなどの新興感染症に対するワクチンの開発に従事しているDUです。室温で、滅菌済みの2X HBSSバッファー、pH 7.2の2.5 mM CaCl₂、およびRBDプラスミドのアリコートを融解します。

溶液を融解させた後、2 XHBS 2 mLを50 mLコニカルチューブに移します。15 mLチューブ内で、塩化カルシウム 200 µLとRBDプラスミド 40 µgを混合します。滅菌済みの5 mLピペットを使用し、室温の滅菌蒸留水で液量を2 mLに調整します。混合液を緩やかに定速でボルテックスしながら、プラスミド溶液を2 XHBSに滴下して加えます。

高いトランスフェクション効率を得るために、適切なコンシステンシーの沈殿物を形成させるには、このボルテックスを低速で連続的に行うことが不可欠です。室温で20分間静置します。このインキュベーションの後、混合液を、コンフルエンシーが50〜70%の2 9 3 T細胞を含むフラスコに滴下します。

40 millilitersの細胞培養培地において、トランスフェクション溶液を均一に分散させることが重要です。トランスフェクションミックスを添加した後、すぐに培地を混合してください。細胞を37 degrees Celsius、5%carbon dioxideのインキュベーター内に置いてください。

8〜10時間インキュベートした後、完全細胞培地を除去し、その後のタンパク質精製において血清による干渉を避けるため、50 mLの新鮮な無血清Opti-MEM培地で置換し、細胞を37 °Cのインキュベーターに戻します。2日後、発現したRBDタンパク質を含む上清を回収し、6,000 RPMで15分間遠心分離して細胞残渣を除去します。細胞がペレット状になったら、上清を新しいチューブに移し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。

タンパク質の分解を防ぐため、製造元の指示に従ってnickel NTA super flowを用い、回収した上清からRBDリコンビナントタンパク質を精製します。250 millimolar oleを含むバッファーでRBDタンパク質を溶出させます。次に、Emon Ultra 15チューブを用い、3000 RPM、4 °Cで約15分間遠心分離し、OLEを含む精製タンパク質を濃縮します。ろ液は廃棄してください。

RBD濃度チューブにPBSを加え、4°C、3000 RPMで20分間、再度遠心分離します。この洗浄操作を2回繰り返します。完全に除去されたことを確認するため、精製タンパク質をPBSに溶解させ、清潔な1.5 mLのEORチューブにタンパク質をピペットで移します。

最後に、PBSをブランクとしてNanoDropを用いて精製タンパク質の濃度を測定し、サンプルを-80°Cで保存します。まず、Sigmaアドジュバントシステムのバイアル1本に、滅菌PBS 1 mLを加えます。40〜45°Cのウォーターバスで予熱し、バイアルを2〜3分間十分にボルテックスします。

次に、1.5 mLのエッペンチューブでタンパク質アジュバントエマルションを調製します。PBSで希釈し融解させた所定量の精製タンパク質と等量のアジュバントシステムを混合し、2〜3分間激しくボルテックスします。また、アジュバントとPBSのみを混合してコントロールエマルションを調製します。皮下投与します。

4〜6週齢のBCマウス少なくとも5匹に対し、1回あたり20 µgのタンパク質を含む初回免疫混合液、またはコントロールエマルションを、初回接種から21日後に皮下へ各200 µLずつ注入します。その後、10 µgのタンパク質を最終量200 µLに調製したブースター用量を注入します。初回免疫前および各ワクチン接種の10日後に各マウスから血液サンプルを採取し、分離した血清を加熱後-20 °Cで保存します。

トランスフェクションの16時間前に、補体を56 °Cで30分間加熱して不活化させます。293T細胞を100 mm組織培養ディッシュに、1ディッシュあたり2 million cellsの密度で播種します。前述の手順に従ってトランスフェクション試薬を調製し、SARS-CoV Sタンパク質をコードするプラスミドと、ENV欠損ルシフェラーゼ発現HIV-1ゲノムをコードする別のプラスミドを細胞に共導入します。トランスフェクションから8〜10時間後。

培地を10%血清を含む新鮮なDMEM培地10 millilitersに交換し、細胞をインキュベーターに戻します。2日後、SARS擬似ウイルスを含む上清を回収します。上清を0.45 micronのシリンジフィルターでろ過して細胞残渣を除去し、ウイルス分注を行います。

直ちに使用するか、マルチチャンネルピペットプレートを用いて-80°Cで冷凍保存して後で使用してください。96ウェル組織培養プレートに、SARS-CoV受容体ACE2を発現させた293T細胞を1ウェルあたり100 µLあたり10,000 cellsの濃度で播種し、37°Cで16時間インキュベートします。別の96ウェルプレートを用いて、リコンビナントルシフェラーゼを発現させたSARS擬似ウイルスをタイトレーションし、1枚目のプレートのA列およびB列における中和試験に適したウイルス濃度を決定します。

10%F-B-S-D-M-E-Mを各ウェルに150 µLずつ分注します。次に、A1およびB1の行に未希釈のウイルスを150 µLずつ加え、1行目のウェルから次の行のウェルへ150 µLずつ移し替える操作を11行目まで繰り返し、2倍段階希釈をデュプリケートで行います。最後の150 µLは廃棄し、12行目にはウイルスを加えないでください。

連続希釈を行い、ACE 2 93 T細胞を16時間インキュベートした後、ウイルスプレートの各ウェルから100 µLを、細胞を含むプレートの対応するウェルに転移して細胞に感染させます。ウイルスが細胞に感染するよう、細胞を37 °Cで2日間インキュベートします。Ultra 3 84ルミノメーターでプレートを読み取り、各ウェルの感染レベルを判定します。

感染量はルシフェラーゼ活性の強度に比例します。第12列の細胞のみのバックグラウンドRLUよりも相対ルシフェラーゼユニット（RLU）が約1,000倍高いウイルス濃度を、中和試験に使用します。まず、別の96ウェルプレートを用いて中和試験の準備を行い、マルチチャンネルピペットを使用して、第1列のウェルに150 µLの10% FBS-DMEMを、その他の列のウェルに120 µLを分注します。

次に、テストする各マウス血清3 µLを、1列目の重複ウェルに加えます。この例では、最初の2つのウェルにはRBD免疫マウスの50倍希釈血清が入っています。次の2つのウェルには2匹目のRBD免疫マウスの血清が、最後の4つのウェルにはPBS免疫コントロール動物2匹の血清が入っています。マルチチャンネルピペットを用いて、1列目のすべてのウェルから30 µLを2列目のウェルに移し、これを11列目まで繰り返すことで、血清の5倍段階希釈を行います。

残りの30 µLを廃棄し、12列目のウェルには血清を加えない状態で残します。次に、希釈したSARS擬似ウイルスを各ウェルに120 µLずつ加えます。プレートを37 °Cで1時間インキュベートし、マウス血清中の抗RBD抗体がSARS擬似ウイルスに結合し、これを中和させるようにします。

このインキュベーションの後、各ウェルから100 µLの中和ウイルスを、ACE2を発現する293T細胞を含む96ウェルプレートの対応するウェルに分注します。細胞を37 °Cで24時間インキュベートし、感染させます。感染後、マルチチャンネルピペットを用いて上清を除去し、1ウェルあたり100 µLの新鮮な培地と交換します。

37 °Cで72時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出します。マルチチャンネルピペットを用いて、再度上清を除去します。この時点で、マウス血清によって中和されなかった擬似ウイルスは、細胞に感染しているはずです。各ウェルにルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬を60 µLずつ加えます。

プレートを室温のシェーカーに設置し、1〜2時間かけて細胞を溶解させます。細胞の溶解後、細胞溶解液 50 µL を 96ウェルルミノメータープレートに移し、各ウェルにルシフェラーゼ基質を 50 µL 加えます。96ウェルプレートのルミネッセンスモードに設定した Ultra 3 84 ルミノメーターを用いてプレートを読み取り、各ウェルの相対的なルシフェラーゼ活性を評価することで、ウイルスの中和率を算出します。

これらのデータは、達成されたウイルス中和率がRBD免疫マウス由来の血清濃度に比例していることを示しています。対照的に、PBSを注入した動物由来の血清は、これらのデータにおけるどの濃度においてもウイルスの中和に失敗しています。ウイルスの50%が中和される血清タイターであるNT 50は、容易に導き出すことができます。

この手順を試みる際は、自信と忍耐が実験の成功に不可欠であることを忘れないでください。これらのビデオを視聴することで、哺乳類細胞サブクローンで組換えSARSワクチンの発現させ、マウスモデルにおいて中和抗体応答を誘導する能力を判定する方法について、より深い理解が得られるはずです。