口腔病因研究のための細菌–真菌クロスキングダムバイオフィルムの確立

まずは口腔病原性細菌である ストレプトコッカス・ミュータンスと、機会性真菌病原体である カンジダ・アルビカンスの培養から始めます。

分離したコロニーを栄養豊富な培地に移し、一晩抱卵して活発な成長を確保します。

遠心分離機で細胞をペレットで落とします。上澄液を取り除き、細胞を無菌生理食塩水に定められた濃度まで再懸浮させます。

人間の唾液溶液でコーティングされたマルチウェルプレートを使って、口腔環境を模倣します。

C. albicansを加えて培養し、唾液被膜への付着を許可します。非接着細胞を除去するために無菌生理食塩水で洗い流してください。

熱不活化血清を加え、菌糸の発生を刺激するために培養します。余分な血清を洗い流してください。

S. mutansを導入し、その後ショ糖豊富な培地を培養します。S. mutansはグルコシルトランスフェラーゼを分泌し、これはC. albicans mannansに結合します。

この酵素は菌類表面のショ糖をグルカンに分解し、細菌を菌糸に固定し、増殖とマトリックス形成を促進します。

この方法は、口腔病原における微生物間の相乗効果をモデル化した界横断バイオフィルムを得られます。

好気条件下で37度の血液寒天プレート上でS . mutans と C. albicans を培養します。

その後、各生物の単一のコロニーを5ミリリットルの脳心臓注入入りの試験管に移し、さらに18時間培養します。

翌日、培養液を1,200倍gで5分間遠心分離し、上澄液を廃棄します。細胞を生理食塩水に再懸濁し、C. albicansとS. mutansの両方のOD₅₅₀を0.5に調整します。

次に 、S. mutans の懸浮液を1〜10で希釈して同等の濃度にします。無菌唾液50マイクロリットルを光学底面96ウェルプレートのウェルにピペットで抽出し、顕微鏡観察を行います。

プレートを37度で30分間培養し、その後100マイクロリットルの無菌生理用生理食塩水で3回洗い、ウェルを空にします。

各ウェルに100マイクロリットルの C. albicans 懸液を加え、プレートを37度Cで90分間孵育させ、その後生息塩水で3回洗浄します。

次に、各ウェルに100マイクロリットルの熱不活化胎児用牛血清を加えます。プレートを2時間孵育し、その後生理食塩水で3回洗います。

井戸を空にしますが、過剰なせん断力を避けるために20マイクロリットルの貯留層を残してください。各井戸にS . mutans 懸濁液100マイクロリットルと、ショ糖5%を含むBHI150マイクロリットルを加えます。その後、プレートを37度Cで24時間以上孵化します。

古いバイオフィルムを培養する際は、培地を毎日交換してください。クロスキングダム成長期の終わりに、プレートを無菌生理食塩水で5回洗浄します。