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まず顕微鏡ステージに取り付けられたマイクロ流体装置から始めます。
この装置は、ポリマーガラス構造体で、円筒形の柱を持つマイクロチャネルを囲んでおり、多孔質の媒体を模倣しています。
シリンジポンプはフィルター付きのシリンジを通じて培養培地をチャネルに送り込み、チャネルは出口チューブを通じて廃棄物容器に排出されます。
チャネルに接続されたセンサーを使って基準液圧を監視してください。
出口チューブを細菌の懸濁液が入ったバイアルに入れます。
フローを逆流させて、サスペンションがチャネルを満たすまで続け、フィルターが細菌の侵入を防ぎます。
細菌細胞が表面に付着し増殖し、バイオフィルム形成を開始するために培養します。
その後、フィルターを外して出口を廃棄容器に戻します。
培地の流れを再開し、バイオフィルムが成長してチャネルを塞ぐにつれて圧力を監視してください。
タイムラプス顕微鏡画像を撮影し、バイオフィルムの成長を時間とともに観察します。バイオフィルムの成長と圧力の変化を相関させ、多孔質培地におけるバイオクロッガーの研究を行う。
実験の3時間前に顕微鏡の箱型インキュベーターを起動し、25度の安定した温度を確保します。
入口と出口のチューブをマイクロ流体装置に接続します。チューブと注射器の接続を、外径0.6ミリの針を入口チューブに差し込んで固定します。マイクロ流体装置、脱イオン水30ミリリットル、培養培地30ミリリットルを真空乾燥器に入れ、少なくとも1時間脱ガスします。
終わったら、培養培地と脱イオン水をゆっくりと2つの30ミリリットルの注射器に分けます。次に、マイクロ流体装置を顕微鏡に取り付け、出口チューブを廃棄物容器に入れます。脱イオン水で満たされた注射器をマイクロフルイドチャネルに接続し、圧力センサーの出口から水を排出するまでゆっくりと注入します。
圧力センサーに水を入れ、マイクロフルイドチャネルと圧力センサーをつなぐチューブの泡をすべて洗い流してください。圧力センサー専用のネジで圧力センサーの出口を閉じてください。残りのマイクロ流体チャネルを脱イオン水で満たします。
次に、培養培地注射器に1.2マイクロメートルのフィルターを置きます。水注射器を取り外し、慎重に注入用のマイクロ流体チューブに接続してください。注射器をシリンジポンプに取り付けた後、培養培地でチャネルを1時間あたり2ミリリットルの流量で1時間洗浄します。
その後、実験中にシリンジポンプを希望の流量に設定し、圧力センサーの圧力読み取り値をゼロにします。次に、 Bacillus subtilis NCIB 3610の1ミリリットル、光学密度0.1、波長600ナノメートル、1.5ミリリットルの遠心分離バイアルにピペットを投与します。マイクロ流体チャネルに細菌培養液を装填するには、出口チューブを遠心分離バイアルに入れ、チューブの出口から潜在的な気泡を除去するために5分間待ちます。
完了後、マイクロ流体チャネルが細菌培養で満たされるまで、150マイクロリットルの細菌溶液を1時間あたり1ミリリットルの流量で抽出します。その後、培養用メディアシリンジフィルターを慎重に取り外し、出口を廃棄物容器に入れます。細菌細胞をマイクロ流体チャネル内でゼロフロー状態に3時間放置し、多孔質培地内で表面付着を促します。
実験を開始するには、シリンジポンプを所望の流量に設定し、圧力測定を1ヘルツから開始し、成長中のバイオフィルムの画像を希望の時間間隔、光学配置、倍率で取得します。