共培養における微生物間相互作用を研究するためのin vitroアッセイ

まずバイオアッセイプレートを使い、1つは栄養寒天の左側に コリネバクテリウム・プロピンクム で事前に定着させ、もう1つは栄養寒天のみを含んでいます。

次に、病原性 ブドウ球菌 懸濁液を含むマルチウェルプレートを用意します。

接種スタンプを井戸に差し込み、その先端が ブドウ球菌 の培養物に浸されます。

切手をくるくると回し、持ち上げて各先端に均一な滴がついているか確認し、均一な接種を確実にします。

スタンプをバイオアッセイプレートの右側に合わせ、既存のコロニーとの接触を避けてください。

切手を剥がし、寒天にブ ドウ球菌 の接種斑点を残します。

寒天単独プレートにスタンピングを繰り返して単一培養を生成します。プレートを逆さまに孵化させます。

共培養では、 C. propinquum はシデロフォアと呼ばれる小分子を分泌し、寒天から鉄を回収することで ブドウ球 菌の成長を抑制します。

潜伏後は、共培養と単一培養における ブドウ球菌 の成長を比較します。

共培養における有意な抑制は、両種間の相互作用を示唆しています。

バイオアッセイプレートの6日間の培養後、前述の通りターゲット菌の一晩の培養を準備します。ターゲットプレートは、空の12ウェルプレートの各ウェルに1.8ミリリットルのBHIと200マイクロリットルのターゲット培養液を充填して準備します。標的プレートに無菌接種スタンプを貼り付けます。

井戸の周囲の培養物を優しく攪拌し、隣接する井戸との交差汚染を防ぎます。接種スタンプを持ち上げ、各スタンプ先端に希釈された標的培養液の滴がついていることを確認してください。接種スタンプを未接種のバイオアッセイプレートに置き、優しく揺らして培養液滴が各ウェルに接種するようにします。

スタンプが除去されると、井戸内に培養液の滴が見えるはずです。もし接種スタンプが施されていないウェルがあれば、ピペットを使って希釈した一晩の培養液3マイクロリットルをウェルに塗り付けます。次に、前述の通りバイオアッセイプレートに接種しつつ、スタンプの先端を12ウェルプレートの右側に合わせ、スタンプが既存の細菌コロニーに接触しないようにします。スタンプを慎重に取り外し、ターゲットプレートに戻してください。

寒天がウェル内で不均一に固まっている場合は、スタンプを優しく前後に揺らしますが、スタンプがテスト生物の成長に入らないように注意してください。

すべてのプレートが接種されるまで各バイオアッセイプレートに対して接種を繰り返し、適切な温度で逆さまにして7日間培養します。

試験と標的生物を1週間共培養した後、視覚的評価に基づいて相互作用を評価します。単一培養と区別がつかない成長を示す標的生物の成長を持つウェルをゼロと評価します。成長減退の井戸を1つ、成長なしを2つに評価します。