がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

まず、覆いの上に付着したがん上皮細胞を含むマルチウェルプレートから始めます。

病原性細菌である シゲラ・フレクスネリを加えましょう。

細胞との接触を促進するために遠心分離機でプレートを使い、その後培養します。

シ ゲラ は特殊な分泌系を用いて、上皮細胞に病原性タンパク質を注入します。

これらの病原性タンパク質は上皮シグナル伝達系を調節し、細菌の取り込みを促進します。

細胞内で細菌は病原性タンパク質の分泌を続け、細胞翻訳を妨げ、未翻訳のmRNAを蓄積します。

RNA結合およびシグナル伝達タンパク質は未翻訳のmRNAと集まり、膜のない細胞質顆粒であるストレス顆粒を形成します。

培地は捨てて洗い、未付着の細菌を取り除きます。

次に、表面付着した細菌を除去するためにゲンタマイシンを補った予温培養培地を加えます。

細胞構造やストレス顆粒を保護するために固定剤を加えましょう。

固定剤は捨て、優しく振って残留物を洗い流します。

細胞はシ ゲラ誘発性ストレス顆粒を可視化するための免疫蛍光染色の準備が整っています。

洗浄液を1ウェルあたり500マイクロリットルの感染培地に置き換え、24ウェルのプレートを遠心分離して細菌を細胞に回します。

沈着した細菌共培養を37度の組織培養インキュベーターに30分間移し、宿主細胞の感染を促進します。

培養終了時には、1回の洗浄ごとに1ミリリットルの新鮮な37度のHeLa培養培地に3回洗浄し、細胞から外因性細菌を除去します。

その後、感染した細胞にゲンタミシンを含む新鮮培地1ミリリットルを塗り、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。

1時間後に上澄液を完全に吸引し、常温の4%パラホルマルデヒドをPBSで30分間固定します。

次に、固定剤を適切な廃棄物容器に捨て、カバースリップを1ミリリットルのトリスバッファー生理食塩水で2分間、優しく振って洗います。