マウス腎組織における細菌定着の蛍光イメージング

まず、遺伝子操作されたグラム陽性菌に感染したマウスの腎臓から始め、その菌が組織に定着し病変を形成します。

すべての細菌細胞は赤色蛍光を発現し、病変特異的な宿主条件では特定の細胞内で緑色蛍光タンパク質の発現が可能となります。

腎臓を固定剤で処理し、暗闇で培養して組織構造を保存し、細胞膜を部分的に透過させます。

臓器を適切な培地に埋め込み、冷凍し、薄い組織のスライスに分けます。

スライスを帯電ガラススライドに置いて接着性を高めます。

組織を核染料で染めます。

この染料は宿主や細菌の細胞に浸透し、DNAに結合します。

カバースリップを組織にかぶせ、特定のイメージングチャネルを使って蛍光顕微鏡でスライドを観察します。

核染色は宿主と細菌のDNAを輪郭として示します。

組織内のすべての細菌は赤色蛍光を発現し、緑色蛍光発現は宿主と病原体相互作用の部位を示します。

適切な実験段階で、腎臓、心臓、肝臓、肺、脾臓を15ミリリットルのポリプロピレン管に10%緩衝ホルマリンを含ませ、室温の暗い環境で24〜48時間、優しく振るまたは回転させて培養します。

固定の最後に、臓器を透明な組織凍結培地に埋め込み、マイナス80度の環境で保存します。クライオスタットを使って厚さ10マイクロメートルの組織切片を取得し、事前に洗浄されたチャージしたガラススライド上で暗闇で20分間乾燥させた後、DAPIを補ったハードマウント培地を適用します。その後、カバースリップを貼り、スライドを室温で一晩硬化させた後、サンプルを4度の長期保存に移します。

サンプル内の病変を特定するために、レーザー走査型共焦点顕微鏡のステージにスライドを置き、適切な対物レンズを使って個々の細胞を可視化して病変の画像を取得します。