表面誘発細菌病原性をスクリーニングするための迅速画像ベースのアッセイ

まずは表面付着細菌とプランクトニックまたは自由浮遊細菌を含むプレートから始めます。

両方のサンプルにアメーバ細胞を加えます。

各サンプルの上に、細胞透過性染料であるカルセイン-AMを含むアガロースパッドを置きます。

余分な液体を取り除き、乾燥させて培養します。

表面に付着した細菌がいるプレートでは、表面接触によって病原性遺伝子が上方調節され、毒素が発現します。

これらの毒素はアメーバの膜を破壊し、その形状を変えます。

損傷したアメーバ膜はより多くのカルセイン-AMを細胞質に侵入させ、細胞内エステラーゼがそれらを蛍光カルセインに分解して蓄積させます。

一方、表面接触ができないプランクトン細菌は病原性を保ち、アメーバ膜をそのまま残します。これによりカルセイン-AMのアメーバへの侵入が減少し、蛍光カルセインの蓄積が制限されます。

健康なアメーバも非病原性細菌を飲み込みます。

蛍光顕微鏡下では、明るく丸いアメーバ細胞は病原性のある細菌相互作用を示し、暗く非定形のアメーバは非病原性細菌の相互作用を示します。

表面付着細菌細胞の病原性を測定するには、以前に得られた表面付着細菌細胞からアメーバ細胞10マイクロリットルを加えます。

プランクトニック細胞を分離するために、10マイクロリットルの培養液を新しいペトリ皿に移します。

次に、アメーバ細胞10マイクロリットルを既に得られたプランクトン菌と混合してプランクトン細胞の病原性を測定します。

すぐに小さな寒天パッドを適切なバクテリアアメーバ混合物の上に置き、ペトリ皿の表面に置きます。

その後、余分な液体を優しくピペットで拭き取り、20分間乾燥させます。

蓋をして常温でさらに40分間孵化させます。最後に、蛍光顕微鏡を使って少なくとも100個のアメーバ細胞の画像を取得します。