Bacillus subtilisにおけるペリクル形成に対する阻害剤の効果評価

まずは土壌細菌である Bacillus subtilisの培養を栄養豊富な培地で育てます。

遠心分離機で細菌をペレット化し、上清液を廃棄し、化学的に定義された培地でペレットをバイオフィルム形成を支える液質に再懸浮させます。

培養物の光学密度を測定し、適切な細菌濃度を決定します。

培養液を、対照用に定義された培地と阻害剤付きの定義培地を含むウェルに加えます。

静的な条件下で孵化します。細菌は上方に移動し、空気と液体の界面に蓄積します。そこでは酸素の利用可能性が増えることで細菌の成長が支えられます。

制御井戸では、界面の細菌が細胞外マトリックス成分を分泌し、ペリクルと呼ばれる浮遊するバイオフィルムを形成します。これは細菌の生存を促進する保護層です。

試験井戸では阻害剤がマトリックス合成を妨げ、細菌集団が分散します。

このアッセイは、阻害剤が細菌の病原性の重要な特徴であるバイオフィルム形成を阻害することを示しています。

まず、適切な単一のコロニーを選び、LBブロス3ミリリットルに移します。このスターター培養液を37度のシェイクインキュベーターに4時間入れます。孵化後、スターター培養液1.5ミリリットルを取り、遠心分離機で4分間過ごします。

上澄液を慎重に除去し、その後1.5ミリリットルのMSgg培地にペレットを再び懸浮させます。ペリクルを培養するには、各ウェルに3ミリリットルのMSggを加えて12ウェルの培養プレートを準備します。これらのウェルのいくつかには、濃度範囲内の小分子阻害剤を含むMSggを加え、皿内の異なる濃度の位置を分散させてエッジ効果を避けます。

再懸濁スターター培養液の600ナノメートルでの光学密度を測定します。培養は0.6から1の間でするべきです。これはシステムの堅牢性にとって非常に重要です。

培養プレートの各ウェルに再懸濁スターター培養液3マイクロリットルを接種します。その後、23度の温度で静的な条件下で3日間培養します。その後、培養皿をインキュベーターから取り出し、ペリクルを観察します。