形態学的解析のための細菌バイオフィルムコロニーの準備

まずは栄養寒天プレート上で細菌バイオフィルムコロニーを培養します。

これらのバイオフィルムは、被包された細菌を宿主の免疫反応から守る疎水性の細胞外マトリックスで構成されています。

固定剤を加え、プレートを優しく回転させてバイオフィルムが浮き始めるまで動かします。

プレートを密封し、バイオフィルムの構造を保つために優しく振って培養してください。

固定液を取り除き、バッファーを加えて培養し、バイオフィルムの構造を安定させます。

パスツールピペットを使って、コロニーをアガーから優しく剥離します。

エタノール濃度を増やして細菌の群落を脱水させます。

浮遊するコロニーをエタノールに浸したフィルターペーパーに移し、密閉チャンバーで自然乾燥させます。

乾燥したコロニーをカーボンテープでコーティングされたスタブとブリッジにカーボンテープで取り付け、電子ビームによる充電を防ぎます。

次に、バイオフィルムに導電性の金属層をコーティングしてイメージングコントラストを高めます。

バイオフィルムは電子顕微鏡による形態解析の準備が整いました。

サンプル固定を始めるには、まず希望するバイオフィルムコロニー数分の十分な新鮮固定液を準備します。各ペトリ皿に5ミリリットルの固定剤を慎重に加え、コロニーに直接ピペッティングするのは避けてください。コロニーはアガーから離れて浮かび上がります。

プレートをパラフィルムで慎重に密封し、室温の回転シェーカーで2時間培養します。プレートを4度の保管に一晩移してください。

バキュームに接続されたパスツールピペットで固定液を優しく取り出します。

100ナノモルのカコジル酸ナトリウム10ミリリットル、塩化カルシウム緩衝液5ミリモラを加えてバイオフィルムを洗浄し、5分間培養します。パスツールピペットでバイオフィルムコロニーの中心部をアガープレートから慎重に切り離します。

コロニーを自然乾燥させるには、セルロースフィルターペーパーを四つに切り、100%エタノールに浸して一部を浸します。

浮遊するバイオフィルムコロニーを慎重に紙に移します。紙を乾いたろ過紙を敷いたペトリ皿に入れます。その後、皿に蓋をして、化学フードに入れて一晩乾かします。

バイオフィルムコロニーの形態を保つためには、浮遊するバイオフィルムの下にセルロース紙を完全に覆うことが重要です。一度紙に貼り付くと、バイオフィルムは再調整できません。

電子顕微鏡のスタブにカーボンテープを塗り、ピンセットでバイオフィルムコロニーを慎重にスタブに移します。

各コロニーをスタブに接続した後、薄いカーボンテープの橋を付けてスタブを乾燥器で24時間または必要な時まで保存します。

この段階では、バイオフィルムが非常に脆く、簡単に割れやすいため、安定した正確な手が必要です。課題は、バイオフィルムの大部分をひび割れなく取り付けることです。

検査当日、群落を金パラジウムのス