食中毒菌を用いたゼブラフィッシュ幼虫の腸内感染モデル化

まず、蛍光発現タンパク質を発現する病原性 大腸菌 に感染したパラミシアを含むマルチウェルプレートから始めます。

麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫を加え、自然な摂食環境を模して昼間に共抱卵させます。

孵化中、幼虫は意識を取り戻し、感染したパラミシアを捕食します。

摂取後、ザラミシアは消化され、 大腸 菌が腸管に放出されます。

細菌の定着は前方の腸から後方の腸へと進行し、食中毒を模倣します。

次に、麻酔剤を添加した培地で幼虫を洗浄し、再麻酔します。

その後、幼虫を蛍光イメージングプレート内の低融点アガロースに入れます。

立体顕微鏡を使い、ゼブラフィッシュを整列させてアガロースが固まるまでキュベーションします。

栄養豊富な培地に麻酔剤を重ねて塗ります。

蛍光顕微鏡を用いて幼虫の蛍光 大腸菌 の分布を観察し、細菌感染の進行を評価する

ゼブラフィッシュの食物由来感染については、パラミシアサンプルをE3中濃度の2×10から5のパラミシアに希釈し、各6ウェルプレートの1ウェルに各パラミシア培養液3ミリリットルを加えます。

次に、麻酔を受けたゼブラフィッシュ10匹を各井戸に最小限の液体で移し、共培養物を日中の昼間インキュベーターで30度Cで2時間キュベートします。

孵化終了時には、ゼブラフィッシュを5つの異なるウェルで洗浄し、それぞれ3ミリリットルの新鮮なE3培地に1リットルあたり100ミリグラムのトリカインを補足し、各ゼブラフィッシュを1%低溶融アガロース3ミリリットルの黒い6ウェルプレートに埋め込みます。

すべての魚が埋め込まれたら、プレートを立体顕微鏡の下に置き、クリップしたゲルローディングチップを使って、各観測フィールドで頭部が左側、尾が右側にあることを確認します。

アガロースが固まるまで5分待ってから、埋め込んだ魚の上にトリカインを補った新鮮なE3培地を重ね、蛍光顕微鏡でゼブラフィッシュを画像化して細菌感染の進行状況を評価します。