JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 3:08 分 • March 31st, 2026
まず、嫌気性の胞子形成細菌病原体である クロストリジウム・ディフィシル が消化管にコロニー化しているマウスから始めます。
マウスを拘束し、無菌であらかじめ計量されたチューブに自然に排泄させてください。
空のチューブ重量を総重量から差し引いて、適切な希釈を準備するために糞便サンプルの正味重量を算出します。
酸素感受性細菌の生存能力を保つために、サンプルを嫌気環境に移すこと。
サンプルにバッファーを加え、機械的に攪乱して内容物を懸濁状態に放出します。
より大きなゴミが沈殿し、細菌細胞や胞子を上清液に保持するために培養します。
バッファ内で上清液を連続的に希釈します。
希釈液を選択培地にプレートし、嫌気条件下で培養します。
培地は胞子の発芽とクロス トリジウム・ディフィシル の選択的増殖を促進しつつ、競合する細菌を抑制して独自の群落を形成します。
糞便中のクロストリジウム・ディフィシル負荷を定量化し、消化管での定着を評価するためにコロニー数を数えます。
評価のためにマウスの糞便サンプルを採取するには、まず首と背中のたるんだ皮膚で軽くしかししっかりとマウスを拘束し、動物が苦しんでいないことを確認します。
小指を使って、動物の尾を優しく持ち上げ、肛門を露出させます。動物の肛門の真下に、既知の重量の無菌マイクロ遠心分離機チューブを置き、チューブがマウスに直接触れないようにします。動物が排泄したら、糞便のペレットをチューブに集めます。
必要なサンプルがすべて採取されるまで、チューブは室温で保管してください。糞便入りのチューブを分析スケールで計量し、質量を小数点以下の4桁まで記録します。糞便のペレットの重さをチューブの重さから引いて計算します。
次に、内容物の希釈率を1から10に計算し、1倍PBSに再懸濁します。ピペットの先端を使って、糞便を優しく溶かします。サンプルを室温で30分間培養し、内容物が沈殿するまで待ちます。
溶液を無酸素的に維持し、各サンプルごとに1倍PBSで連続希釈します。各シリアル希釈液を100マイクロリットルずつTCCFAプレートに転写します。滅菌L字型のスプレッダーを使い、培地を均等にプレートに塗布します。
プレートは嫌気性環境、摂氏37度で24時間培養します。最後に、 C. difficile コロニーを列挙し、糞便量あたりのコロニー形成単位を計算します。