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まずは、感受性細菌を除去する抗生物質の濃度を増やして処理した細菌サンプルから始めます。
対応するチューブに、重水素酸化物と同じ抗生物質濃度を含む培養培地を加えます。
チューブを揺らす環境で孵化させます。
重水素酸化物は細菌細胞に入り、新たに合成された生体分子に組み込まれて炭素-重水素結合を形成します。
細菌を脱水させ、上澄液を捨てて洗い流します。
細菌の構造を保つために固定剤を加えてください。
水を加え、遠心分離機で外清液を取り除きます。
細菌を再懸浮させ、その懸濁液をポリL-リジンコーティングされたカバーガラスに移し、密封します。
サンプルを事前に校正された誘導ラマン散乱顕微鏡またはSRS顕微鏡のステージに置きます。水を加えて目標を下げます。
複数の磁場の画像を取得し、炭素-重水素の振動周波数を評価します。
抗生物質濃度が高いと炭素-重水素信号が低下し、細菌の生存能力が低下していることを示します。
これにより、SRSシグナル強度と細菌の生存可能性を相関させることで、抗生物質感受性の迅速な評価が可能になります。
1時間の培養後、同じ抗生物質濃度の抗生物質前処理細菌300マイクロリットルに、100%重水素を含むMHB培地で連続希釈した抗生物質700マイクロリットルを加えます。混合物をピペットで上下に数回均質化します。抗生物質フリーの100%重水素を含むMHB培地を700マイクロリットルに加え、抗生物質不使用細菌300マイクロリットルを加えてポジティブコントロールを行ってください。
抗生物質フリーの0%重水素を含むMHB培地を700マイクロリットルに加え、抗生物質を含まない細菌300マイクロリットルを加えて陰性対照を行ってください。すべてのマイクロチューブを37度摂氏、毎分200回転で30分間培養します。培養後、抗生物質および重水素処理済み細菌サンプル1ミリリットルを6,200 g の圧力で4度の温度で5分間遠心分離します。その後、ペレットを浄水で2回洗います。サンプルを体積ごとに10%のホルマリン溶液に固定し、4度の温度で保存します。
サンプルの準備では、1ミリリットルの固定細菌溶液を精製水で洗浄し、洗浄した細菌溶液を6,200 g の遠心分離機で4度Cで5分間処理します。
上澄液を取り除き、滅菌水で細菌溶液を約20マイクロリットルまで濃縮します。細菌溶液をポリL-リジンコーティングされたカバーガラスに沈着させ、別のカバーガラスとサンドイッチしてサンプルを密封します。細菌サンプルを60倍の水浸し目標の下に置く。細菌サンプルのSRSイメージングを開始してください。各サンプルに対して少なくとも3つの視野角をイメージしてください。