Name: 骨格筋からのミトコンドリア単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ骨格筋からのミトコンドリア単離と呼吸測定法。遠心分離とポリグラフィーを用いて酸素消費を解析し、代謝機能を評価します。この手法は筋肉代謝研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、国立眼研究所（R01 EY12998）からFH Andradeさんへの助成金によって支えられている。

1。バッファーの調製<ol><li>遠心5804Rの電源を入れ、4℃に設定37℃にIsotemp 3006D水浴とセットの電源を入れ</li><li>筋肉の分離の前に以下のソリューションを準備します。 <ul><li> PBS：蒸留水（5粒/リットル）にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）タブレットを溶かす。よく混ぜる。 </li><li> PBSを加えた10mMのEDTA：100mlの溶液を調製するためには、PBSの98 mlに500 mMのEDTAの2 mlを加える。 </li><li> 8Xミトコンドリアバッファー：0.6 Mの最終濃度のスクロース10.28グラム、遊離脂肪酸の400mgのウシ血清アルブミン（BSA）0.8％、160 mMの最終濃度のためのHEPESの2.08グラム、pHの最終濃度蒸留水で50mlに7.4〜とQS。 </li><li>絶縁バッファ1（IB1は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、最終濃度10 mM、500 mMのEDTA 200μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。 </li><li>絶縁バッファ2（IB2は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、3 mMの最終濃度は500 mMのEGTAの60μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。 </li><li>実験的なバッファー（EB）：の最終濃度2.5mMのKH 2 PO 4を25μl、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、5 mMの最終濃度を500 mMのMgCl 2の100μlを追加する6.25μM、20μMの最終濃度を100 mMのEGTAを2μl、ミトコンドリアの緩衝液、pH7.4にし、QS蒸留水で10mlまでの1.25ミリリットル。 </li></ul></li></ol> 2。筋肉のアイソレーション<ol><li>アイスバケットでは、3つの10 mlのビーカー、ポッター-エルベージェム組織グラインダーと氷の上の楽器/消耗品その他のすべての必要を置く。すべては、実験を通して氷冷滞在する必要があります。 </li><li>行って温水槽でアイスバケットとEBのIB1とIB2を置きます。 </li><li> three 10ミリリットルのビーカーでは、以下のソリューションを追加する必要があります。 <ul><li>ビーカー1：PBSを10ml </li><li>ビーカー2：PBS / EDTAを10ml </li><li>ビーカー3：IB1 3 mlの</li></ul></li><li>人道的としてローカルの動物実験使用の委員会によって承認されたラットを殺す。 </li><li>急速に、骨格筋の250から500ミリグラムを分離ビーカー1で洗い流した後、ビーカー2に転送します。 </li></ol> 3。均質化/ミトコンドリア単離<ol><li>ビーカー3に筋肉を移し、細かくはさみで筋肉を飾らない。 </li><li>ポッター-エルベージェムホモジナイザーに解決策を転送する。電動乳棒（ドリルプレスの仕事をする）すべての回で氷の中にチューブを保持する10回を使って筋肉をホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間、700 グラム ℃であらかじめ冷却した2 mlのマイクロチューブや遠沈管にホモジネート転送</li><li>新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移す。ペレットを捨てる。 </li><li> 4℃で10分間、10500 グラムで上清を遠心℃に</li><li>新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN1（清番号1）と筋肉の種類に上清を移す。 </li><li> IB2500μlにペレットを再懸濁する。 </li><li> 4℃で10分間、10500 グラムで遠心℃、 </li><li>新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN2（清番号2）と筋肉の種類に上清を移します。 </li><li> IB2の100μlの最終的なミトコンドリアペレットを中断します。 </li><li>数秒間minifugeのリスピン最終ミトコンドリア懸濁液。ペレットがある場合は、新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移すと、ペレットを捨てる。 </li><li>ブラッドフォードアッセイ8を使用してタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 4。電極のキャリブレーション注：ミトコンドリア分離時の完全な電極のキャリブレーション。 <ol><li> 250mlのフラスコに100mlの蒸留水を追加。大気中のガスと水を平衡化し、20分間激しく攪拌。 </li><li> Oxygraph電極にKClを50％の数滴を追加します。 </li><li>電極の上にブルーリズラ圧延紙の小片を置きます。 </li><li>ローリングペーパーの上にPTFEの膜の一部を置きます。 </li><li>リングのアプリケーターを用いて内輪を適用し、電極の溝に外輪を置きます。 </li><li>電極を接続し、機器の残りのアセンブル：大きなプラスチック製のリングのベース、ミトコンドリア室、および水のホースを。 </li><li> Oxygraphボックスをオンにし、Oxygraphのソフトウェアを起動します。 </li><li>ミトコンドリア室に平衡水を追加。 </li><li>攪拌棒を、60の速度にオン追加。 </li><li>新しい実験を始める。 </li><li>キャリブレーションをクリックし、ボックス1の液相のキャリブレーション。温度を37に変更° Cと"OK"を2回クリックします。 </li><li> "OK"と"上書き"の変更は、それをクリックし、窒素ガスのタンクを開くと。 </li><li>接続されている場所のヒントチャンバー内に窒素タンクへとゼロ酸素を確立する。それが切り替わる時、"OK"をクリックして"上書き。" </li><li>水を吸引し、ミトコンドリアのチャンバーへのEB緩衝液500μlを加える。 </li><li>プランジ​​ャーとシールチャンバー。 </li><li>ボックス2のキャリブレーションのため11月15日、複数のボックスは、手順を使用している場合。 </li></ol> 5。ミトコンドリア呼吸<ol><li>新しい実験を開始し、その信号を安定させるために約1分間実行してみましょう。 </li><li>各チャンバーに150μgのためにミトコンドリア懸濁液（ステップ3.11）の必要量、マークイベントを追加し、それが1分間実行してみましょう。 </li><li> 5 mM/2.5 mMの最終濃度のウォーム250 mM/125 mMのグルタミン酸/リンゴ酸を10μlを添加します。マークし、1分間実行してみましょう。これは、状態2のように定義されます。 </li><li> -150μMの最終濃度10 mMのADP7.5μlの、マークを、追加し、30秒間実行してみましょう。これは状態3と定義されています。 </li><li> 10 mMのADP、マークの別の7.5μlのを追加し、1.5分間実行してみましょう。 </li><li> 1μM、マークの最終濃度のために冷10 mMのオリゴマイシンの0.5μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態4のように定義されます。 </li><li> 0.2μM、マークの最終濃度のコールド0.1mMのFCCPの1μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態5として定義されています。 </li><li>終了したら、実験を終了して保存する。 </li><li> Oxygraphソフトウェアを使用して呼吸速度を取得する。 </li><li>正規化係数を入力してください：ミトコンドリアタンパク質150μgを添加すると、正規化係数は0.15となります。 </li><li>さまざまな呼吸状態のために正規化された呼吸速度を計算する。 </li><li>状態4によって状態3で割って呼吸調節率（RCR）を計算する。 </li></ol> 6。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1は、。ミトコンドリア骨格筋での酸素消費量のトレース代表を示しています。電極信号が安定した後、ミトコンドリアサンプルはOxygraph室に追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸とリンゴ酸の添加により開始されます。 ADPの添加は、状態3呼吸を定義する、酸素消費量を増加させる。 ATP合成酵素は、状態4呼吸を得るためにオリゴマイシンを添加することによってブロックされます。最後に、FCCPはミトコンドリア呼吸（状態5）を切り離すために追加されます。 表1は、状態2、3、4、5の代表的酸素消費率を示しています。呼吸調節率（RCR）は、それぞれの実験のために計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。 <table border="1"><tbody><tr><td> 国 </td><td> 正規化されたレート </td></tr><tr><td>状態2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td>状態3 </td><td> 153.40 </td></tr><tr><td>状態4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td>状態5 </td><td> 143.70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> 表1。ミトコンドリア呼吸速度。ミトコンドリア骨格筋からRepresentativeoxygen消費率。値は、チャンバーに追加されたミトコンドリアの量に正規化されます。呼吸調節率（RCR）が状態4によって状態3で割ることによって決定されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備を表します。

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、骨格筋から実行可能なミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提示する。歩留まりに問題がある場合、プロトコルは氷中で30分間PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン5mlに分離された筋肉をインキュベートすることによって変更することができます。トリプシンとの完全な筋肉の消化を確保するために、筋肉は完全にみじん切りする必要があります。 30分間のインキュベーション後、PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン溶液を完全にアイソレーションバッファ1（IB1）3mlで交換する必要があります。さらに、トリプシンの使用は、呼吸のプロトコル中にあるミトコンドリアの基質を妨げる可能性があります。トリプシンを用いて良好なミトコンドリア調製物中のこのプロトコルの結果で使用されているすべての基板。 マウス骨格筋の場合、それは両足から腓腹筋を組み合わせる、または全体のダイアフラムを使用するのが最適です。ラット骨格筋の場合は、腓腹筋や横隔膜の小さなセクションで十分です。過度の筋肉量は収率の低下に分離手順と結果を複雑にすることができます。このような外眼筋のような非常に小さな筋肉の分離...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 混合ガス</td><td>地元のガス供給業者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&amp;#8242;-二リン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Blue Rizla Paper</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォードタンパク質定量アッセイ</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>カルボニルシアニド p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>圧縮窒素</td><td>地元のガス供給業者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコールビス(テトラ酢酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>遊離脂肪酸除去牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPESナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>雄性Sprague Dawleyラット</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心機</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>酸素電極ディスク</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 ソフトウェア</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem ホモジナイザー</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125mm &amp;#215; 25mm) メンブレン</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 ボードリル</td><td>ホームセンター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

ミトコンドリア細胞の生と死を制御する細胞内小器官です。彼らは、主要な代謝反応に関与ATPの大部分を合成し、カスケード2,3をシグナリングの数を調整する。過去と現在の研究者は、肝臓、脳や心臓4,5としてラットやマウスの組織から単離ミトコンドリアいる。近年、多くの研究者は、骨格筋のミトコンドリア機能の研究に焦点を当てている。 ここで、我々は骨格筋6からミトコンドリアを単離するために正常に使用した方法を説明します。この場合の手続きは、すべてのバッファーと試薬が新鮮作られ、骨格筋の250から500まで約100mgを必要している必要があります。我々は、ラットとマウス腓腹筋と横隔膜から単離したミトコンドリアを研究し、ラットの眼の筋肉。ミトコンドリアタンパク質濃度はBradfordアッセイで測定されます。それは、ミトコンドリアのサンプルが準備中に氷冷状態に保つことと機能に関する研究が比較的短い時間（〜1時間）以内に測定することが重要です。ミトコンドリア呼吸は37クラーク型電極（Oxygraphシステム）° C 7でポーラログラフ分析を用いて測定されます。酸素電極のキャリブレーションは、このプロトコルの重要なステップであり、それを毎日実行する必要があります。単離ミトコンドリア（150μg）を実験的バッファー（EB）の0.5mlに追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸の添加（5mMの）とリンゴ酸（2.5 mM）で始まります。その後、アデノシン二リン酸（ADP）（150μM）は状態3を起動するために追加されます。オリゴマイシン（1μM）、ATPアーゼの酵素ブロッカーは、状態4を推定するために使用されます。最後に、カルボニルシアニドp型[トリフルオロメトキシが] -フェニル-ヒドラゾン（FCCP、0.2μM）は5 measurestateに追加、または呼吸6非結合される。呼吸調節率（RCR）、状態4から状態3の比率は、各実験後に計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。 要約すると、我々は、生化学的（例えば、酵素活性、免疫、プロテオミクス）と機能に関する研究（ミトコンドリア呼吸）で使用することができる骨格筋から実行可能なミトコンドリアの単離のための方法を提示する。

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました<em&gt;ら。</em&gt;（2007）。ミトコンドリアの単離方法は、約2時間を必要とします。ミトコンドリア呼吸は約1時間で完了することができます。

ミトコンドリアは、細胞の生死を制御する細胞小器官である。ミトコンドリアは主要な代謝反応に関与し、大部分のATPを合成し、そして……

この手順の全体的な目的は、ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア呼吸を測定することです。まず、Sprague Dawleyラットから骨格筋を採取します。次に、その筋肉をホモジナイズし、遠心分離によってミトコンドリアを単離します。その後、ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を決定します。最後に、ポリグラフ法によりミトコンドリア呼吸を測定します。これにより、異なるミトコンドリア呼吸状態における酸素消費量を示す結果を得ることができます。この手法は、ミトコンドリア機能に対するさまざまな介入の影響など、骨格筋分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は骨格筋の代謝に関する知見を提供しますが、肝臓、脳、腎臓、あるいはほぼあらゆる組織など、他の臓器にも適用可能です。手順を開始する前に、骨格筋を単離するための以下の溶液を調製してください：PBS、10 mM EDTA添加PBS、8×ミトコンドリア単離バッファー、単離バッファー1（IB1）、単離バッファー2（IB2）、および実験バッファー（EB）。手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。次に、遠心機を起動し、温度を4°Cに設定します。ウォーターバスを起動し、温度を37°Cに設定します。適切なバケツに、10 mLビーカー3本、ポッター・エルボー、組織ホモジナイザー、小型手術用ハサミ、および10 µLマイクロ遠心チューブを入れ、氷上に置きます。実験中はすべてを氷冷状態で維持する必要があります。IB oneおよびIB twoを氷上に置き、EBを温水バスに入れます。次に、氷上の3つのビーカーに以下の溶液を加えます。ビーカー1には10 mLのPBS、ビーカー2には10 mLのPBSEDTA、ビーカー3には3 mLのib.1を加えます。まず、地域の機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認された手順に従って、ラットを安楽死させます。次に、ピンセットとメイヨークレ scissorsを用いて、骨格筋を250から500 milligrams迅速に分離します。それをbeaker 1で洗浄し、次いで筋肉をホモジナイズするため、beaker 2に移動させます。まずbeaker 3に移し、最後にハサミで細かく刻みます。溶液をPotter-Elvehjemホモジナイザーに移し、チューブを常に氷上に置いた状態で、電動ペッスルを用いて筋肉を10回ホモジナイズします。次に、ホモジネートをあらかじめ冷却した2 mLマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで700 ×gにて10分間遠心分離します。上清を新しい冷却済みマイクロ遠心チューブに移し、ペレットは廃棄します。4°Cで10分間、10,500 Gsで遠心分離し、その上清を新しいマイクロ遠心チューブに移して、「SN1」および筋肉の種類を記載してラベルを貼ります。ペレットを500 µLのIB2に懸濁させ、4°Cで10分間、10,500 Gsで遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、「SN2」および筋肉の種類を記載してラベルを貼ります。最終的なミトコンドリアペレットを100 µLのIB twoに懸濁させます。ミニ遠心機で数秒間遠心分離します。ペレットが生じた場合は、上清を新しいあらかじめ準備したマイクロ遠心チューブに移し、ペレットは廃棄してください。酸素電極の校正はこのプロトコルにおける重要なステップであり、毎日行う必要があります。電極の校正はミトコンドリアの分離中に完了させることができます。まず、250 mLのフラスコに100 mLの蒸留水を加え、20分間激しく撹拌します。水を大気ガスと平衡させるために、GRAT電極を50%塩化カリウム数滴で覆います。次に、電極の上に青色のRizlaローリングペーパーの小さな断片を置きます。続いて、ローリングペーパーの上にPTFEメンブレンの断片を置きます。リングアプリケーターを使用してインナーリングを装着し、次にエレクトロード溝にアウターリングを配置します。電極を接続し、大型プラスチックリングベース、ミトコンドリアチャンバー、およびウォーターホースを組み立てます。GRATボックスの電源を入れ、GRASソフトウェアを起動します。平衡化した水をミトコンドリアチャンバーに加えます。次に、スターバーを加え、スターバーを回転させます。ハードウェアをクリックしてください。次に、攪拌を開始します。回転数を60に調整し、オンをクリックしてください。その後、新しい実験を開始します。「calibrate（校正）」をクリックし、次に「liquid phase calibration（液相校正）」を選択します。ボックス1の温度を37 °Cに変更し、「okay」を2回クリックします。「override」が「okay」に変わったら、それをクリックして窒素ガスタンクを開きます。窒素タンクに接続したチップをチャンバー内に配置し、酸素濃度をゼロにします。オーバーライドから切り替わったら、「OK」をクリックします。水を吸引し、ミトコンドリアチャンバーに 500 µL の EB を加えます。プランジャーでチャンバーを密閉します。複数のボックスを使用する場合は、各ボックスに対してキャリブレーションの手順から繰り返してください。新しい実験を開始し、約1分間走らせます。信号を安定させるため、各チャンバーの量が150 microgramsになるよう、必要な量のミトコンドリア懸濁液を添加します。イベントをマークし、そのまま走らせます。1分間、温めた250 millimolar glutamateおよび125 millimolar malateを10 microliters添加し、最終濃度が5 millimolar glutamateおよび2.5 millimolar malateとなるようにマークして、1分間走らせます。これを状態2と定義します。次に、最終濃度が 150 µM になるように、10 mM ADP を 7.5 µL 加えます。その後、マークして 30 秒間走らせます。これをステート3と定義します。10 mM ADPをさらに 7.5 µL 添加し、1.5 分間測定します。次に、最終濃度が 1 µM となるように、冷却した 10 mM オリゴマイシンを 0.5 µL 添加し、3 分間測定します。これをステート4と定義します。最終濃度が0.2 µMとなるように、冷えた0.1 mM FCCPを1 µL加え、3分間RUMさせます。これをステート5と定義します。完了したら、実験を終了して保存します。raftソフトウェアを用いて呼吸速度を取得してください。正規化係数を入力します。150 µgのミトコンドリアタンパク質を添加した場合、標準化係数は0.15になります。異なる呼吸状態における標準化呼吸速度を算出してください。ステート3をステート4で除して、呼吸制御比（RCR）を算出します。この図は、骨格筋ミトコンドリアによる酸素消費量の代表的なトレースを示しています。電極信号が安定した後、ミトコンドリア試料をGRATチャンバーに添加します。状態2において、グルタミン酸とリンゴ酸の添加により呼吸が開始されます。ADPの添加により酸素消費量が増加します。これを状態3と定義します。リガマイシンの添加によりATP合成酵素を阻害することで、状態4の呼吸を得ます。最後に、ミトコンドリア呼吸を脱共役させるためにFCCPを添加します。この図は、ステート2、3、4、および5における代表的な酸素消費速度を示しています。各実験において、呼吸制御比（RCR）が算出されます。RCRが4より大きい場合は、生存可能なミトコンドリア調製物である証拠と見なされます。本手順を行う際は、ミトコンドリアサンプルを常に氷上に保持することが重要です。本手順に従ってください。ミトコンドリアタンパク質の含有量など、さらに詳細な疑問を解決するために、ウェスタンブロットなどの他の手法を実施することも可能です。このビデオを視聴することで、骨格筋からのミトコンドリアの単離方法およびミトコンドリア呼吸について十分に理解できるはずです。

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。...

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。...

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。...

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離 

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

学ぶ骨格筋からのミトコンドリア単離と呼吸測定法。遠心分離とポリグラフィーを用いて酸素消費を解析し、代謝機能を評価します。この手法は筋肉代謝研究に応用可能です。

骨格筋からのミトコンドリア単離

さらに動画を探す