骨格筋からのミトコンドリア単離

この手順の全体的な目標は、ミトコンドリアを分離し、ミトコンドリア呼吸を行うことです。これは、最初にスプレードリーラットから骨格筋を分離することによって達成されます。次に、筋肉を均質化し、ミトコンドリアを遠心分離によって単離します。

次に、タンパク質濃度をBradfordアッセイを使用して決定します。最後に、ミトコンドリア呼吸はポリグラフィーによって測定されます。最終的には、さまざまなミトコンドリア呼吸状態を通じて酸素消費量を示す結果を得ることができます。

この方法は、ミトコンドリア機能に対するさまざまな介入の影響など、骨格筋領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法は骨格筋の代謝についての洞察を提供することができますが、肝臓、脳、腎臓、またはほとんどすべての組織などの他の臓器にも適用できます 手順を開始する前に。骨格筋を単離するには、P-B-S-P-B-Sと10ミリモルEDTAの溶液、8倍のミトコンドリアバッファー分離バッファー1またはIB1、分離バッファー2またはIB2、および実験バッファーまたはebを調製します。

手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。次に、遠心分離機の電源を入れ、摂氏4度に設定します。ウォーターバスの電源を入れ、摂氏37度に設定します。

素敵なバケツに、10ミリリットルのビーカー3つ、陶芸家の肘、宝石ティッシュグラインダー、小さな手術用ハサミ、10本のマイクロ遠心チューブを氷の上に置きます。実験中、すべてが氷のように冷たく保たれなければなりません。IB1とIB2をICEとEBに温水浴に入れます。

次に、氷のビーカーの3つのビーカーに次の解決策を追加します:PBSビーカーの10ミリリットル1つ、PBSe-DDTAビーカーの2つの10ミリリットル。3。3ミリリットルのib。1つは、地元の施設の動物管理およびジュース委員会によって承認された手順に従ってラットを安楽死させます。

次に、鉗子とマヨクリニックのはさみで骨格筋の250〜500ミリグラムを迅速に分離します。それをベカ1ですすぎ、次にベカ2に移して、筋肉を均質化します。まずはビーカー3に移し替え、最後にハサミでミンチにします。

溶液を陶芸家のエルバジェムホモジナイザーに移し、電動乳棒を使用して筋肉を10回均質化し、チューブを常に氷の中に保ちます。次に、ホモジネートを予め冷却した2ミリリットルのマイクロ遠心分離機、チューブに移し、摂氏4度で700Gで10分間遠心分離機にかけます。S上清を新しいファイルされたマイクロ遠心チューブに移し、ペレット遠心分離機を廃棄します。

10、500 Gsで10分間のS上清 摂氏4度で、SNATを新しいプレフィルドマイクロ遠心チューブに移し、SN oneと筋肉タイプReeseで標識します。ペレットを500マイクロリットルのIB 2に懸濁し、次いで摂氏4度で10分間10,500Gで遠心分離する。すくい酸を新しいプレフィルドマイクロ遠心チューブに移し、SN 2と筋肉タイプで標識します。

最終的なミトコンドリアペレットを100マイクロリットルのIB 2に懸濁します。ミニフージで数秒間回転させます。ペレットがある場合は、スパーミン酸塩を新しいプレフィルドマイクロ遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します 酸素電極のキャリブレーションは、このプロトコルの重要なステップであり、毎日実行する必要があります。

電極のキャリブレーションは、ミトコンドリアの分離中に完了できます。まず、100ミリリットルの蒸留水に250ミリリットルのフラスコスターを20分間激しく加えます。水を大気ガスで平衡化するには、GRAT電極を50%塩化カリウムを数滴垂らします。

次に、電極の上に青いリズラ巻紙の小片を置きます。次に、PTFEメンブレンの一部。巻紙の上に。

リングアプリケーターを使用して内輪を取り付け、外輪を電極溝に配置します。電極を接続し、大きなプラスチックリングベース、ミトコンドリアチャンバー、ウォーターホースを組み立てます。GRATボックスの電源を入れ、GRASソフトウェアを起動します。

平衡化した水をミトコンドリアチャンバーに加えます。次に、攪拌子を追加して攪拌子をオンにします。ハードウェアをクリックします。

次に、速度をかき混ぜます。速度を60に調整してクリックします。次に、新しい実験を開始します。

[キャリブレーション]をクリックしてから、液相キャリブレーションをクリックします。ボックス1では、温度を摂氏37度に変更し、[OK]を2回クリックします。オーバーライドがに変わったら、それをクリックして窒素ガスタンクを開きます。

窒素タンクに接続されたチップをチャンバーに入れ、酸素をゼロにします。オーバーライドから切り替わったら、[OK]をクリックします。水を吸引し、500マイクロリットルのEBをミトコンドリアチャンバーに加えます。

チャンバーをプランジャーで密閉します。複数のボックスを使用する場合は、ボックスごとにキャリブレーション手順を繰り返します。新しいテストを開始し、約 1 分間実行します。

シグナルを安定させるには、必要な量のミトコンドリア懸濁液を添加して、各チャンバーに150マイクログラムに到達させます。イベントをマークして実行させます。1分間、10マイクロリットルの温かい250ミリモルグルタミン酸、125ミリモルのリンゴ酸を加えて、5ミリモルのグルタミン酸、2.5ミリモルのリンゴ酸マークの最終濃度を作り、1分間実行します。

これは状態 2 として定義されます。次に、7.5マイクロリットルの10ミリモルa DPを添加して、最終濃度を150マイクロモルにします。次に、マークを付けて30秒間実行します。

これは状態 3 として定義されます。さらに7.5マイクロリットルの10ミリモラーをDPマークに追加し、1.5分間運転させます。0.5マイクロリットルの冷たい10ミリモルオリゴマイシンを加えて最終濃度を1マイクロモルマークにし、3分間実行します。

これは状態 4 として定義されます。1マイクロリットルの冷たくした0.1ミリモルのFCCPを加えて最終濃度を0.2マイクロモルマークにし、RUMを3分間待ちます。これは状態 5 として定義されます。

終了したら、実験を終了して保存します。いかだソフトウェアを使用して呼吸数を取得します。正規化係数を入力します。

150マイクログラムのミトコンドリアタンパク質を追加すると、正規化係数は0.15になります。さまざまな呼吸状態の正規化された呼吸数を計算します。呼吸制御比またはRCRは、状態3を状態4で割って計算します。

この図は、骨格筋による酸素消費量の代表的なトレースを示しています。ミトコンドリア。電極シグナルが安定した後、ミトコンドリアサンプルをGRATチャンバーに加えます。状態2、呼吸はグルタミン酸とリンゴ酸の追加から始まります。

差圧を添加すると、酸素消費量が増加します。状態 3 の定義。呼吸 TPシンターゼは、リガマイシンの添加によってブロックされ、状態4の呼吸が得られます。

最後に、FCCPはミトコンドリア呼吸を分離するために追加されます。この図は、州 2、3、4、および 5 の代表的な酸素消費率を示しています。呼吸制御比またはRCRは、実験ごとに計算されます。

RCRが4より大きい場合、この手順を試みている間、生存可能なミトコンドリア調製の証拠と見なされます。ミトコンドリアのサンプルは常に氷の中に置いておくことが重要です。この手順に従います。

ウェスタンブロットのような他の方法は、ミトコンドリアタンパク質の含有量などの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見た後、骨格筋からミトコンドリアを分離する方法とミトコンドリア呼吸を十分に理解しているはずです。