植物抽出病原体からの遺伝子発現の単細胞解析

感染した植物から単離された病原性細菌の懸浮液を例に挙げましょう。

細菌ゲノムには転写融合が含まれており、病原性調節遺伝子のプロモーターが下流のプロモーターなし蛍光タンパク質遺伝子の発現も駆動します。

植物感染時には、プロモーターの活性化が調節タンパク質と蛍光タンパク質の産生を引き起こします。

調節タンパク質は病原性遺伝子を活性化し、蛍光は病原性活性化の測定可能な読み取り値を提供します。

細胞を遠心分離し、上清液を捨ててから再懸濁させて濃縮懸濁液を得る。

カバースリップに一滴を置き、アガロースパッドを重ねて細胞を広げて固定します。

すべての細菌細胞を特定するために明視野画像を撮影し、その後単一細胞蛍光を検出するために蛍光画像を撮影します。

両者を統合することで蛍光強度の違いを可視化し、高病原性、低病原性、または全無のサブポピュレーションを明らかにします。

この表現型変異は、植物の定着時に細菌の生存を促進する適応戦略を反映しています。

単細胞分析の場合は、蒸留水中で1.5%のアガロース溶液を準備します。溶かしたら、並べて置いた2枚の顕微鏡スライドの間のスペースを満たすだけの容量を加え、その上にもう一枚スライドを置きます。15分間運転させ、上部に置いたスライドを慎重に外してください。

使用前に刃物を使ってアガロースパッドを5ミリ×5ミリの塊に切り分けます。並行して、アポプラスト抽出された細菌を1ミリリットル遠心分離機で行います。ピペットで上清液を慎重に除去し、ペレットを20マイクロリットルの水に再懸濁して細胞を濃縮します。

濃縮細胞を2マイクロリットルの滴を0.17ミリメートルのカバースリップに置き、その滴をアガロースパッドで覆います。特定のレーザーを用いて共焦点顕微鏡下で細菌の調製を可視化し、緑色蛍光菌を識別します。明視野を使ってすべての細菌を特定し、両方のフィールドを統合します。