細菌感染検出のための葉から総DNA抽出

まず、菌器に感染した冷えた葉の組織の小さな断片から始めます。

DNA分解性ヌクレアーゼの活性を抑制するために、その破片を液体窒素とともにモルタルに入れます。

細胞を機械的に破壊し、細胞内成分を放出するために粉砕します。

冷えたヘラで粉末を移し、リュシスバッファーを加えて懸濁液を渦巻きます。

植物の核や細菌細胞を溶解するためにインキュベートし、DNAとRNAを放出しつつタンパク質を変性させます。

RNaseを加えてインキュベートし、RNAを分解します。

タンパク質沈殿バッファーを凝集タンパク質に加え、遠心分離機で分離します。

植物および細菌を含む上清液をイソプロパノールに移し、DNAを糸状の鎖として沈殿させます。

遠心分離機でDNAを採取し、上清液を廃棄します。

エタノールで洗浄し、遠心分離機で上清液を捨てます。

DNAを自然乾燥させ、その後再水和バッファーを加えて培養し、溶解させます。

DNAサンプルは現在、下流のPCRベースの病原体検出に備えています。

きれいなハサミで柑橘類の木から新鮮な葉を丸ごと切り取り、きれいなビニールのサンドイッチ袋に入れます。次に、少量の液体窒素を加えて乳鉢と乳棒を冷やします。次に、はさみで葉組織の小さな片を約1平方インチほど切ります。

葉片をモルタルに入れてすぐに凍らせます。すぐに乳鉢で葉の組織を粉砕し、液体窒素が蒸発し、細かい緑色の粉末が残るまで続けます。次に、金属製ヘラを液体窒素で10〜15秒間冷やします。次に、冷たいヘラで1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブでモルタルからすくい上げます。1000マイクロリットルのピペットを使って、600マイクロリットルの核溶解液をサンプルに加えます。その後、サンプルを1〜3秒間ボルテージします。チューブを65度の水浴で15分間孵化させます。

培養期間終了後、10マイクロリットルのピペットで3マイクロリットルのRNase溶液を溶解液に加え、RNAを除去します。次に、チューブの中身を2〜5回逆さに混ぜます。キャビネットインキュベーターで37度の環境で15分間培養します。15分後に、サンプルに200マイクロリットルのタンパク質沈殿液を加えます。高速で20秒間チューブを渦巻かせろ。

次に、サンプルを13000gで3分間遠心分離します。遠心分離の過程で、室温で維持したイソプロパノール600マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに加えます。遠心分離が終わった後、上清液を慎重に遠心分離機管からイソプロパノール入り管へ取り出します。ペレットは捨てる。

チューブを逆さにしてDNAを糸のような糸のように見えるようにします。次に、13000gで室温で1分間遠心分離します。

遠心分離後に上清液をデカントします。次に、70%エタノールを600マイクロリットルペレットに加えます。チューブを何度か逆さにしてペレットを洗います。チューブを13000gで1分間遠心分離します。遠心分離が終わったら、上清液を慎重に吸引します。次に、蓋を開けた状態でチューブを逆さにして吸収性の紙に乗せて15分間自然乾燥させます。乾燥したら、ペレットに100マイクロリットルのDNA再水和溶液を加えます。DNA懸濁液を65度の水浴で1時間孵化します。