ヒト細胞へのプラスミド導入を用いたシュードウイルスの作製

栄養豊富な培地で培養したヒト胚性腎細胞を含む培養フラスコから開始します。

細胞へのプラスミド導入効率を高めるため、培地をクロロキンを含む新鮮な培地と交換します。

インフルエンザ表面タンパク質、レンチウイルスコアタンパク質、およびレンチウイルスゲノムをコードするプラスミドの混合物と、リン酸カルシウムを準備します。これらをインキュベートし、リン酸カルシウム-DNA複合体を形成させます。

混合液を細胞に添加し、静かに混ぜ合わせる。その後、複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれるまでインキュベートする。クロロキンは、プラスミドDNAのエンドソーム脱出を促進する。

細胞内において、プラスミドDNAがインフルエンザおよびレンチウイルスの両方の構成要素の発現を誘導します。

過剰な複合物を除去するため、培地を交換します。

ウイルス成分をアセンブリさせ、擬似ウイルスとして出芽させ、培養液中に放出させるためにインキュベートします。

擬似ウイルスを含む培地を回収し、遠心分離して細胞破片を沈殿させる。

シュードウイルスを含む上清を回収し、後続のアッセイのために低温で保存します。

まず、完全DMEM培地を用いてHEK 293FT細胞の単一細胞懸濁液を作成します。T75フラスコに単一細胞懸濁液を10 mL加え、37 °Cでインキュベートします。

トランスフェクションの2時間前に、古い培地をクロロキンを含む10 mLの新鮮な完全培地に交換します。原稿に記載されている通りに、試薬とプラスミドDNAを混合します。その後、この混合液を細胞上の培地に加え、静かに揺らして混ぜ合わせます。

インキュベーション後、培地を15 mLの新鮮な完全DMEM培地に交換します。65時間後、遠心分離により上清を回収します。上清を回収し、分注します。