ジャガイモにおけるジャガイモウイルスXを用いたmicroRNAサイレンシング

in vitroで育成したジャガイモ植物を用意する。

次に、転移DNA（T-DNA）を持つ植物病原菌である組換えAgrobacteriumを使用します。

T-DNAは、特定の植物microRNAを捕捉するための非コードRNAをコードするように設計された、フルレングスのジャガイモウイルスXゲノムを保持しています。

細菌を葉に浸潤させ、細菌を塗布した爪楊枝で茎を擦ります。

接種部位において、細菌はT-DNAを切り出し、単鎖DNAとして植物細胞内に転移させます。

宿主の機構を利用して、T-DNAがウイルスゲノムRNAを産生し、それが複製されて非コードRNAおよびウイルスタンパク質が発現します。

非コードRNAが標的となる植物マイクロRNAに結合することで、それらが標的mRNAに結合するのを妨げ、発生異常を誘発します。

その間、ウイルスのゲノムRNAはリボ核タンパク質複合体を形成し、原形質連絡を通じて全身的に拡散することで、植物体全体でmicroRNAサイレンシングを可能にします。

異所的な外方成長やトランペット状の葉などの葉の異常は、サイレンシングされたmicroRNAの発達上の役割を示しています。

600 nmでの吸光度が1.0に達したら、遠心分離によりAgrobacterium液体培養物を回収し、ペレットを十分な量の浸潤バッファーで再懸濁して、600 nmでの吸光度を1.0に調整します。

室温で6時間インキュベートした後、1 mLの針なしシリンジにAgrobacterium懸濁液を充填し、片手でジャガイモ植物の展開葉を裏返して保持します。

片方の手の指で、浸潤させたい部位の葉身を向軸側から支え、もう一方の手でシリンジを葉面に垂直に保持し、100～200 µLのAgrobacterium培養液を葉身の背軸側へ浸潤させます。

次に、爪楊枝を使用してAgrobacterium培養プレートからコロニーを回収し、浸潤させたジャガイモ植物の第1または第2節間の茎表面および茎の表皮を擦ります。その後、浸潤させた植物を温室で2～4週間育成します。