アデノ随伴ウイルスに対する網膜透過性を評価するためのマウス網膜凍結切片の作製

緑色蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルスを事前に注入した、網膜バリア破壊マウスモデルから採取した眼球を用意します。

網膜バリアが破綻することでAAVが光受容細胞に浸透し、そこでウイルスゲノムが発現してGFPが産生されるため、細胞が蛍光を発します。

眼球を解剖して角膜と水晶体を取り除き、眼杯をそのまま残します。

網膜構造を保存するため、眼球（アイカップ）を固定液に浸します。

眼球杯を、濃度の異なる凍結保護剤溶液に順次移します。その後、氷晶の形成を防ぐため、最終濃度の溶液でインキュベートします。

眼球を凍結包埋剤に埋め込み、凍結させます。

クライオスタットを使用して、眼杯を薄い切片に切り出します。

切片をスライドガラスにマウントします。組織を透過処理し、その後の免疫染色において抗体が浸透できるように、界面活性剤を含む緩衝液を添加します。

切片を洗浄します。免疫染色の際の非特異的な抗体相互作用を防ぐため、ブロッキング溶液で処理します。

網膜の凍結切片が、その後の免疫染色手順および蛍光イメージングに使用可能な状態になりました。GFP陽性の蛍光細胞は、ウイルス導入が成功したことを示しており、網膜の透過性が認められます。

安楽死させた注射済み動物から眼球を摘出した後、眼球を解剖して水晶体と角膜を取り除きます。次に、解剖した眼球を4%パラホルムアルデヒドに1時間浸漬固定します。1時間後、室温で10%スクロースを用いて眼球をさらに1時間凍結保護します。その後、室温で20%スクロースに20分間浸します。

最後に、眼球を30% sucrose溶液に浸し、4 °Cで一晩置きます。翌日、Cryo-matrixなどの包埋樹脂を用いて眼杯を包埋し、凍結させます。その後、クリオスタットを用いて10 µmの切片を作成し、凍結組織用に調製されたスライドガラスにマウントします。

次に、スライド上の切片を界面活性剤で5分間透過処理します。続いて、PBSで短時間に2回洗浄します。その後、眼球組織を室温で1時間ブロッキングします。