網膜膜整合性の低下を可視化するためのAAV媒介性遺伝子導入

蛍光タンパク質をコードする目的遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルス（AAV）を事前に注入した、トランスジェニックマウスの眼から開始します。

このマウスは、網膜と硝子体腔を隔てるバリアである内境界膜（ILM）の完全性を維持するために不可欠な遺伝子を欠損しています。

この遺伝子の欠損は網膜変性を模倣し、ウイルスが網膜の細胞層のより深部まで浸透することを可能にします。

感染した網膜細胞は目的の遺伝子を発現して蛍光タンパク質を産生し、これにより蛍光を発します。

次に、眼球を解剖し、角膜と水晶体を除去します。

網膜を、網膜色素上皮（RPE）および眼球の外層である強膜から慎重に剥離します。

組織を固定液に浸します。

リン酸緩衝液で洗浄し、残留した固定液を除去する。

共焦点顕微鏡で観察すると、網膜細胞における蛍光は、損傷した内境界膜を通じてウイルスが正常に浸入したことを示しています。

網膜フラットマウントを作成する場合、摘出した眼球を4%パラホルムアルデヒドで15〜30分間固定し、解剖しやすくします。この固定および解剖後の固定を適切に行うことは、GFP蛍光を保持するために極めて重要です。固定後15〜30分以内に、眼球を解剖して角膜と水晶体を除去します。

鋸歯縁と視神経の周囲を切除することで、網膜を網膜色素上皮および強膜から分離します。解剖後、組織および導入された網膜細胞内の蛍光タンパク質を固定するため、網膜を4%パラホルムアルデヒドにさらに30分間浸します。固定後、pH 7.4の滅菌PBSで検体を5分間洗浄します。