組換えB型肝炎ウイルス粒子の作製および精製

コラーゲンコートしたディッシュで培養した肝細胞から開始します。

2つのプラスミド（一方は改変されたB型肝炎ウイルス（HBV）ゲノムを保持し、もう一方はウイルスの構造タンパク質をコードするもの）を複合体化したトランスフェクション試薬を導入します。

プラスミドが細胞内に導入されるまでインキュベートします。細胞内でウイルス遺伝子が発現して構造タンパク質と修飾されたHBVゲノムが産生され、これらが会合してリコンビナントHBV粒子を形成します。

培地を交換し、ウイルス粒子の産生および放出を促進させるためにインキュベートします。

培地を回収し、遠心分離してデブリをペレット化する。

上清を回収し、フィルターでろ過して残りのデブリを除去する。

次に、ウイルス粒子を沈殿させるためにポリエチレングリコールと塩化ナトリウムを加えます。

遠心分離して内容物をペレット化します。ペレットをバッファーで溶解し、デブリを遠心沈殿させます。その後、それをショ糖クッションの上に積層します。

超遠心分離を行い、クッションを通してウイルス粒子を沈降させます。

上清を除き、ペレットを培地で再懸濁させる。

懸濁液をろ過し、精製した組換えHBVを低温で保存して、後続の解析に使用します。

細胞培養培地を調製した後、トランスフェクションの前日に、4 x 10^6個のHepG2細胞を培地とともに10 cmコラーゲンコートディッシュに播種する。細胞を、加湿された5% CO2インキュベーター内にて37 °Cで培養する。₂ インキュベーターを使用する。メーカーの指示に従い、トランスフェクション試薬を用いて、5 µgのpUC1.2HBVを細胞にトランスフェクションする。Δε、および5 $\mu$gのpUC1.2HBV/NL。

翌日、培地を除去し、10 mLの新鮮な培地を加えます。その後、トランスフェクションから1週間後、組換えHBVを含む培地を50 mLチューブに移します。

次に、培養液を回収し、2,300 x gで5分間遠心分離して、リコンビナントHBVを含む細胞残渣を除去します。上清を0.45 µmのメンブレンフィルターでろ過します。その後、ろ液に等量の25%PEG、1.5 M NaClを加え、穏やかに混合します。

サンプルを4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、溶液を2,30 x g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを0.5 mLのTNE緩衝液に溶解します。次に、リコンビナントHBVを含むTNE 0.5 mLを、TNE中の20% sucrose 0.8 mLの上に載せます。

10,0 x g、15 °Cで3時間、遠心分離します。上清を可能な限り除き、開始時の培養液40 mLあたり1 mLの無血清DMEMを用いてペレットを再懸濁します。懸濁液を4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、懸濁液を0.45 µmフィルター