組換えデンソウイルスを用いた蚊の幼虫における遺伝子サイレンシング

ウイルス感染への感受性が高い、蚊の低齢幼虫を用意する。

幼虫を脱イオン水を入れたビーカーに移します。

標的となる幼虫遺伝子を抑制するmicroRNAをコードするように設計した組換えデンソウイルスを導入し、インキュベートする。

幼虫がウイルスを取り込み、その後、ウイルスは腸に到達します。

摂取されたウイルスは腸上皮を通過し、他の組織へと拡散します。

ウイルスはエンドサイトーシスによって幼虫細胞内に進入し、そのDNAを核内に放出します。

ウイルスDNAがマイクロRNAを産生します。

細胞質において、これらのmicroRNAはRNA誘導サイレンシング複合体に結合します。

この複合体は相補的な標的幼虫mRNAに結合して切断し、発現を阻止することで遺伝子サイレンシングを誘導します。

インキュベーション後、幼虫を脱イオン水で洗浄し、摂取されなかったウイルス粒子を除去します。

幼虫を回復させるため、餌が入った新しいプレートに移してください。

標的遺伝子がサイレンシングされたウイルス感染蚊幼虫が、後続のアプリケーションに使用可能な状態で準備できました。

脱イオン水を用いて、1齢のA. albopictus幼虫10匹を3回洗浄します。その後、幼虫を95 mLの脱イオン水を含むビーカーに移します。

rAaeDVストックを5 mL加え、幼虫を28 °Cで24時間インキュベートします。幼虫への感染を成功させ、高い感染率を確保するためには、幼虫を感染ウイルス粒子と共に24から36時間保持することが不可欠です。インキュベーション後、幼虫を脱イオン水で3回洗浄し、幼虫をプレートに戻します。その後、幼虫に定期的に餌を与えてください。