透過電子顕微鏡を用いた加熱処理済みウイルスカプシドの可視化

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遺伝物質を含まないウイルス様粒子であるウイルスキャプシドを含むチューブを用意します。

チューブを一定の温度で、時間を変えて加熱します。

加熱時間を短くするとカプシドタンパク質に軽いストレスがかかり、加熱時間を長くするとカプシドが崩壊して凝集が起こります。

チューブを急速に冷却し、さらなる構造変化を防ぎます。

液体をパラフィンフィルム上に転移させます。

透過電子顕微鏡(TEM)用グリッドを液滴の上に置きます。これにより、カプシドがグリッドの表面に付着します。

フィルターペーパーでグリッドをブロットし、過剰な液体を除去します。

緩衝液で洗浄して弱く結合したカプシドを除去し、その後、再度グリッドをブロットしてください。

カプシド表面に結合してTEM下でより暗く見えるようにする重金属染色剤であるウラン酢酸に浸します。

グリッドをブロットし、プレート上に置きます。プレートをデシケーターに保管し、水分を除去します。

TEMを用いてグリッドを撮像し、熱誘導によるカプシドの損傷を可視化する。

以前と同様に熱処理を行うが、10 millimolar HEPES(pH 7.4)をPBSに置き換え、処理後のカプシドの追加希釈は行わない。次に、処理済みカプシド溶液の15 microliterのドロップ全量をパラフィンフィルム上にピペットで分注する。ピンセットでグリッドの端を掴み、グリッドを保持したまま、処理済み溶液のドロップの上にグリッドのカーボン面を下にして置く。

グリッドを10分間インキュベートし、カプシドをグリッドに付着させます。カプシド調製物の純度に応じて、処理済みカプシド液滴の後に10~15 µLのHEPES溶液の液滴を直線状に並べて配置し、洗浄を行います。10分後、液滴と共にグリッドを回収します。

グリッドをフィルターペーパーに対してほぼ垂直に当て、液滴を吸い取ります。次に、グリッドを使用して10〜15 µLのHEPES緩衝液の液滴をすくい上げ、30秒間保持します。30秒間の洗浄後、別のフィルターペーパーで吸い取ります。

次に、パラフィンフィルムの空いている領域に、2% ウラニル酢酸溶液を 15 µL 点滴します。グリッドでウラニル酢酸の液滴を拾い上げ、45 秒間保持します。その後、溶液の大部分が除去されるように、ウラニル酢酸をろ紙で吸い取ります。

グリッドがピンセットの水分に付着しないように注意しながら、フィルターペーパーの上にカーボン側を上にして置きます。次に、グリッドを載せたフィルターペーパーを、蓋を開けたガラス製ペトリ皿に入れます。すべての処理についてこの工程を繰り返した後、グリッドを入れたペトリ皿の半分をデシケーターに入れ、TEMで観察するまで一晩乾燥させます。