スピロヘータ細菌におけるバクテリオファージ介在性遺伝子導入

遺伝子改変されたスピロヘータ細菌の培養物を準備します。これらの細菌はジェンタマイシン耐性遺伝子を保持しています。

細菌培養液にバクテリオファージ懸濁液を添加します。

ファージは、カナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドDNAを保持しています。

混合物をインキュベートします。

バクテリオファージが細菌の表面に付着し、DNAを細胞内に注入します。

プラスミドは独立して複製され、細菌が分裂する際に受け継がれます。

インキュベートした培養液を、ゲンタマイシンおよびカナマイシン抗生物質を添加した溶融アガロース培地と混合します。

混合液をプレートに注ぎます。凝固させた後、インキュベートします。

2種類の抗生物質による選択条件下では、両方の耐性マーカーを持つ細胞のみが増殖してコロニーを形成し、それ以外の細胞は死滅します。

コロニーを1つ選び、両方の抗生物質を含む培地で接種します。

後続の解析のため、形質導入されたプラスミドを持つ細菌を増殖させるために培養します。

上清をデカントし、ペレットを14.5 millilitersの新鮮なBSKで再懸濁します。受容クローンの培養液に、500 microliters以下のPEG沈殿ファージ試料を添加します。

よく混ぜ合わせた後、33 °Cで72〜96時間インキュベートします。原稿に記載されている通り、PEG沈殿させたファージと混合した後、固相プレート法により導入株の選別を行います。受容体クローンのバックグラウンドに応じて、選別プレートのアガロース内に10〜21日間のインキュベーション後にコロニーが出現しているかを確認してください。

滅菌済みのコットンプラグ付き5.75インチホウケイ酸ガラスピペットを用い、2種類の抗生物質共存下でプレート上に生育したコロニーを少なくとも5〜10個ピックアップし、適切な抗生物質を添加した1.5 millilitersのBSKに接種します。