Nanoformulated抗レトロウイルス薬の血液媒介マクロファージのキャリッジのための方法の開発

本手順の目的は、結晶性抗レトロウイルスナノ粒子（以下、nano artと呼ぶ）を製造し、その細胞内取り込み、分泌、および抗レトロウイルス特性を試験することである。まず、超音波ホモジナイズまたはウェットミリングによって抗レトロウイルス薬を処理する。次に、対向流遠心分離法で分離した原形単球を用いて、nano art粒子の物理的特性を評価する。

これらを、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）を含むDMEMで7日間培養し、単球由来マクロファージへの分化を誘導します。第3のステップでは、ヒト単球由来マクロファージにおけるnano artの取り込み、保持、および放出を検証します。本手順の最終ステップでは、単球由来マクロファージにおけるnano artのin vitroでの抗レトロウイルス有効性を検証します。

最終的に、ナノアートの細胞への促進的な取り込みと緩やかな放出、および強固な抗レトロウイルス効果を示す結果を得ることができます。これらは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による薬物濃度の測定、および逆転写酵素活性の測定による感染培養上清の試験によって決定されます。こんにちは、私はHanta Aldiです。ネブラスカ大学医療センターのHoward Gelman博士の研究室で博士研究員を務めています。

我々が提示する手法は、細胞ベースの薬物送達システムをどのように橋渡し研究活動の開発に活用できるかという、ナノ医療における重要な疑問への回答に寄与します。これは、半減期を延長させたナノ製剤による抗レトロウイルス療法を用いることで達成可能です。我々の研究は、臨床におけるnano artの活用の可能性を支持するものです。

こんにちは。私はCarol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratoryで研究を行っているMD PhD学生のAri Nocheです。Gendelman博士の指導の下、ここでご紹介する技術の応用範囲は抗レトロウイルス療法にまで及びます。なぜなら、ナノ製剤化された化合物は、薬物関連の副作用を軽減させると同時に、バイオアベイラビリティと薬物動態を同時に改善できるためです。臨床的に利用可能な抗レトロウイルス薬をナノ粒子に再パッケージ化することで、服薬コンプライアンスを向上させ、疾患のアウトカムに肯定的な影響を与えることができる可能性があります。

こんにちは、ハワード・ゲンドルマン博士です。私は臨床科学者であり、ネブラスカ大学医療センターの薬理学・実験神経科学科の教授および学部長を務めています。私たちの全体的な目的は、抗レトロウイルス薬を簡素化して入手しやすくし、生体内分布と薬物動態を改善することです。

それでは、アリとショーンに交代します。彼らが研究室をご案内し、これらのナノ粒子の製造と開発の方法について説明します。ネブラスカ大学医療センターにおける臨床的有用性と開発についてです。ウェットミリングによるナノ粒子の製造について説明します。まず、ナノ製剤の作製に使用する薬物結晶と各種界面活性剤を秤量し、T 18 ultra Turraxミキサーを用いて、pH 7.8の10 millimolar HEPES緩衝液で完全に分散するまで混合します。連続ミリングを行う場合、製剤中の薬物含有率は1%から2%の間である必要があります。

チラーとコンプレッサーがオンであり、出口圧力が約100 PSIであることを確認します。次に、粉砕メディアをタンクに充填できるよう準備し、粉砕チャンバーに50 millilitersのビーズを加えます。漏斗を使用し、メカニカルシールからの漏れを防ぐため、ネジ山や粉砕チャンバーの外側にビーズが付着していないことを確認してください。最後に、ミルチャンバーのOリングが正しい位置にあることを確認します。

次に、適切なスクリーンメッシュサイズを選択し、ナットを締めて蓋を固定します。スクリーンメッシュサイズは、ビーズのサイズの少なくとも半分以上にしてください。連続ミル処理中に製品でフィルターが目詰まりするのを防ぐため、大きめのスクリーンメッシュサイズを使用してください。

研磨チャンバーを下げた後、さまざまな量の界面活性剤を含む薬剤懸濁液を製品投入口に加えます。懸濁液の最小容量は 100 milliliters としてください。これにより、ミルチャンバーの過熱を防ぎ、部品の摩耗を抑えてビーズによる汚染を回避することができます。

次に、ポンプを起動します。コントロールユニットを使用して、処方に合わせて流量を調整してください。その後、アジテーターをオンにし、コントロールユニットで速度を調整します。

回転速度は600 rpmから4,320 rpmまで上げることが可能です。マイクロサーにおいては、研磨チャンバー上部に取り付けられた温度計で温度を監視し、過熱が起きていないことを確認してください。次に、さまざまな速度および流量でサンプルをミルし、粒径および電荷を測定するために、分光光度計Malvern Zeta Sizerを用いて、調製液から約1 mLの少量を分注して取り出します。

目的の粒径が得られたら、コントロールユニットを使用してミリングを停止し、ポンプを動作させたままサンプルをフラスコに回収し、薬物を完全に排出させます。終了後は必ずポンプの電源を切り、ビーズを取り出して洗浄してください。次に、ミル懸濁液を50 mL遠心チューブに移し、遠心機を10,000 rpmに設定して30分間遠心分離を行います。

遠心分離サイクルが完了したら、上澄みの量を測定し、同量の新しい界面活性剤溶液で置換します。再懸濁が完了したら、懸濁液をミリングチャンバーに移し、10分間ミリングします。約1 mLのアリコートを分取し、Zeta sizerを用いてサンプルのサイズと電荷を再度測定します。

最後に、ホモジナイズによるナノアート作製のため、HPLCを用いてナノアート処方剤の濃度を測定します。Avastin Emulex C fiveを用い、既述の手順に従って薬物結晶および各種界面活性剤を調製し、懸濁液をホモジナイズ容器に移して再循環を開始します。サンプルのホモジナイズを開始する前に、チラーが作動していることを確認してください。

メーターの値が 20,000 ± 2000 PSI になるまで徐々に圧力を上げ、目標の粒子径に達するまでホモジナイズを続けます。通常、これには 45 ～ 60 分かかります。定期的に約 1 mL のエリクアを採取し、前述した方法でゼータサイザー遠心機を用いて、ホモジナイズした懸濁液のサンプルの粒子径と電荷を測定します。

次に、Resus懸濁液を作成後、その懸濁液をC fiveホモジナイザーに移します。循環を再開し、ホモジナイズ圧力を20,000 ± 2000 PSIに戻し、30分間ホモジナイズします。その後、cold Palmer超音波プロセッサーを用いて超音波処理により作製します。クロロメタンPLGAおよび薬物溶液を1% PVA界面活性剤溶液に注ぎ、超音波処理装置内の氷浴に置きます。

振幅50%で超音波処理を開始します。なお、サンプル量が少ない場合は、振幅を約30%まで下げても構いません。サンプルを10分間超音波処理し、粒子径分析用に少量を分取します。粒子径が1.5 micronsを超える場合は、合計で最大16分になるまで、2分間隔で超音波処理を繰り返します。

顕微鏡を用いてサンプルを20倍の倍率で観察し、その結果を記録します。スターラーを使用して懸濁液に十分な渦を作り、室温で一晩攪拌し続けます。24時間後に懸濁液を回収し、50 milliliter遠心チューブに移します。

サンプルを8,000 rpmで20分間、5 °Cで遠心分離します。上清を除去し、サンプルの半分を75 mLのろ過済み逆浸透水に、もう半分を75 mLの0.5% CTAB（トリメチルアンモニウムブロミド）界面活性剤に再懸濁します。サンプルを再び8,000 rpmで20分間、5 °Cで遠心分離し、各ペレットを合計20 mLのマンニトール溶液で再懸濁します。最後に、ホモジナイゼーションまたはソニケーションのいずれかで製造した粒子について、Zeta Sizerを用いて粒子径を測定し、HPLCを用いてサンプルの濃度を測定します。

顕微鏡による可視化の準備として、調製したナノアート懸濁液を用意し、10秒間超音波処理を行います。超音波プローブを用いて振幅20%で処理します。顕微鏡用スライドガラスのカバーガラスを取り、倒立顕微鏡の上に配置します。カバーガラスの上に

nano art懸濁液15 µLにリン酸緩衝生理食塩水100 µLを加え、ピペッティングを数回繰り返して混合します。次に、20倍の対物レンズを用いてナノ粒子の形態を観察します。また、走査電子顕微鏡による観察用の試料調製を行うことも可能です。

ここでは、遠心分離によって血中単球を分離した後、1×10⁶ cells/mLの濃度で精製単球を以下の添加剤を含むDMEMに懸濁し、A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F 低電圧電界放出形走査電子顕微鏡で得られた画像を示します。次に、6ウェルプレートの各ウェルに2×10⁶ cellsを播種し、5% CO₂を補充した加湿雰囲気下で7日間培養し、単球をマクロファージに分化させ、細胞の取り込みと回収を分析します。nano artを培地で最終濃度100 µMになるように混合し、目的の時点または細胞にnano artが十分に充填された時点で、各ウェルに処理用培地を1 mL加えます。

すべての処理培地を除去し、1 mLのPBSで細胞を3回洗浄して、細胞に取り込まれなかった粒子を除去します。セルリフターを使用してウェルの底から付着細胞を回収し、1.7 mLのマイクロ遠心チューブに入れます。その後、細胞を4°C、1000 RCFで10分間遠心分離します。

上澄みを 제거し、100%メタノールを200 µL加えて細胞を溶解させ、ソニックプローブを用いてペレットを20%の振幅で2〜5秒間短時間ソニケーションし、nano artを溶解させます。薬物含有量を分析するまで、サンプルを-80 °Cで保存します。ここに示すように、ミクロトームで切片を作成した後、透過電子顕微鏡を用いてnano artの細胞内保持を可視化することも可能です。

nano archの放出を解析するための細胞処理の詳細については、細胞の取り込みおよび回収の解析について先に述べた本文を参照してください。ただし、洗浄後に細胞を回収するのではなく、指定された日、または培地が黄色に変化した時点で、PBSをMCSFおよびnano artを含まない細胞培養培地2 mLに置換してください。目的の日に培地の半分を交換します。複製細胞とともに細胞培地を1 mL回収し、薬物解析に供してください。

ナノアート・バイフォーカル顕微鏡を用いてリアルタイムの取り込みを可視化するには、まずVibrantなどのDREを用意し、培地に添加します。製造元の指示に従って、色素を含む培地を成熟した単球由来マクロファージに加え、その後、1 mLの培地を用いて細胞を3回洗浄し、過剰な色素を除去します。次に、蛍光標識したナノアートを培地と混合し、標識ナノアートを含む処理培地を添加します。共焦点顕微鏡によるイメージングの直前に、60倍の対物レンズを用いて、4時間にわたり30秒ごとに画像をキャプチャします。

最後に、HIV-1感染および感染能アッセイを実施できます。まず、art放出の可視化について述べた方法に従って細胞を処理します。次に、目的の日において、すべての培地を除去し、MCSFを含まず、感染多重度（MOI）が細胞あたり0.01 viral particlesとなるHIV-1 A Aを含む培地に入れ替え、24時間インキュベートします。

次に、ウイルス含有培地を除去して新鮮なウイルス培地と交換し、10日間培養します。感染後10日間、細胞の生存を維持するために、1日おきまたは必要に応じて培地の半分を交換してください。各ウェルから10 µLの培地を回収して96ウェルプレートに入れ、逆転写酵素解析を行うまで-80 °Cで保存します。その後、HIV-1 p24検出を行うことも可能です。

ここでは、ナノアート処理の1日後、感染多重度0.01でウイルスに曝露した細胞の形態を容易に観察できます。これらの単球由来マクロファージにおいて、ウイルス感染の証拠は見られず、細胞質内にナノ粒子がはっきりと確認できます。ここでは、ナノアート処理の10日後に細胞をウイルスに曝露させました。

これらの細胞の一部は、P 24染色および多核巨細胞の形成によって示されるように感染していましたが、未処理の細胞と比較して依然として顕著な保護効果が見られました。Bの細胞の細胞質内には依然としてナノ粒子が確認できますが、aで見られたほどではありません。これらの構造は、nano artで処理されていない細胞には存在しません。これらの生細胞共焦点ビデオでは、緑色でラベル付けされたマクロファージと、赤色でラベル付けされたnano artが確認できます。

ここでは、細胞に蓄積されるナノ粒子が非常に少ないことがわかります。一方、こちらでは、赤色蛍光の増加で示されるように、粒子が急速に蓄積しています。これらの差異は、HPLCを用いて薬物取り込みを分析した際に見られる結果と一致しています。さらに、細胞が能動的に粒子を取り込んでいることが確認できます。

細胞内ナノアートの蓄積速度の差は、サイズ、形状、電荷などの物理的特性が、マクロファージのナノアート取り込み能および保持能に及ぼす影響を反映しています。このビデオを視聴することで、ウェットミルホモジナイゼーションおよび超音波処理技術を用いてナノアートを製造する方法について十分に理解できるはずです。これらの手法は、抗レトロウイルス・ナノ粒子の製造に有効な方法です。

ウェットミリングおよびホモジナイズは、脂質界面活性剤内で大きな薬物結晶粒子をより小さなナノ粒子へと分画させるために用いられ、超音波処理技術はポリマー内で個々のナノサイズの薬物液滴を生成します。ここでは、ナノ粒子の輸送を評価するための試験プラットフォームとして、ヒト単球由来マクロファージを使用する方法も実証しました。本試験法により、粒子の細胞への取り込み、保持、放出能力、およびウイルス複製を抑制する能力を非常に簡便にスクリーニングすることが可能になります。

これにより、研究者はin vivoで成功する可能性が最も高く、最終的に感染したヒトへの使用に適したナノアートを特定することができます。これらの実験の完全な結果は、私たちの論文「Online Nano」に掲載されています。この論文は「Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics」という題で、Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010に掲載されました。

ありがとうございました。