Nanoformulated抗レトロウイルス薬の血液媒介マクロファージのキャリッジのための方法の開発

本手順の目的は、結晶性抗レトロウイルスナノ粒子（以下、nano artと呼ぶ）を作製し、その細胞内取り込み、分泌、および抗レトロウイルス特性を検証することである。まず、超音波ホモジナイズまたはウェットミルを用いて抗レトロウイルス薬を処理する。次に、向流遠心分画法により一次単球を分離した後、nano art粒子の物理的特性を評価する。

これらを、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）を含むDMEM中で7日間培養し、単球由来マクロファージへの分化を誘導します。第3段階では、ヒト単球由来マクロファージにおけるnano artの取り込み、保持、および放出を試験します。本手順の最終段階は、単球由来マクロファージにおけるnano artのin vitroでの抗レトロウイルス効果を試験することです。

最終的に、ナノアートの細胞への促進的な取り込みと緩やかな放出、および強力な抗レトロウイルス効果を示す結果を得ることができます。これらは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による薬物濃度の測定、および感染した培養上清物質の逆転写酵素活性の測定によって決定されます。こんにちは、私はHanta Aldiです。ネブラスカ大学 मेडिकलセンターのHoward Gelman博士の研究室で博士研究員を務めています。

我々が提示する方法は、細胞ベースの薬物輸送システムをどのように橋渡し研究活動の展開に利用できるかという、ナノ医療における重要な疑問への回答に寄与します。これは、半減期を延長させたナノ製剤化抗レトロウイルス療法を用いることで達成可能です。我々の研究は、臨床利用におけるnano artの潜在的な有用性を支持しています。

こんにちは、私はCarol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratoryで研究に携わっているMD PhD学生のAri Nocheです。Gendelman博士の指導のもと、ここでご紹介する技術の応用範囲は抗レトロウイルス療法にまで及びます。なぜなら、ナノ製剤化された化合物は、バイオアベイラビリティと薬物動態を同時に改善しながら、薬剤に関連する副作用を軽減できるためです。臨床で利用可能な抗レトロウイルス薬をナノ粒子に再パッケージ化することで、服薬コンプライアンスを向上させ、疾患の転帰に肯定的な影響を与えることができる可能性があります。

こんにちは、ハワード・ゲンデルマン博士です。私は臨床科学者であり、ネブラスカ大学メディカルセンターの薬理学・実験神経科学科の教授兼学部長を務めています。私たちの全体的な目標は、抗レトロウイルス薬を簡素化して入手しやすくし、生体内分布と薬物動態を改善することです。

それでは、アリとショーンに交代します。彼らが研究室へ案内し、これらのナノ粒子の製造および開発方法を説明します。ネブラスカ大学医療センターにおける臨床的有用性と開発について、ウェットミリングによるナノ粒子の製造方法を説明します。まず、ナノ製剤の作製に使用する薬剤結晶と各種界面活性剤を量り取り、10 mM HEPES緩衝液（pH 7.8）に加え、T 18 Ultra-Turraxミキサーを用いて完全に分散するまで混合します。連続ミリングを行う場合、製剤中の薬剤濃度は1～2%にする必要があります。

チラーとコンプレッサーが作動しており、出口圧力が約100 PSIであることを確認します。次に、粉砕メディアをタンクに投入できるよう準備し、粉砕チャンバーにビーズを50 milliliters加えます。漏斗を使用し、メカニカルシールからの漏れを防ぐため、ネジ部や粉砕チャンバー外にビーズが残っていないことを確認してください。最後に、ミルチャンバーのOリングが正しい位置にあることを確認します。

次に、適切なスクリーンメッシュサイズを選択し、ナットを締めて蓋を固定します。スクリーンメッシュサイズは、ビーズのサイズの少なくとも半分である必要があります。連続ミリング中の製品によるフィルターの目詰まりを防ぐため、大きなスクリーンメッシュサイズを使用してください。

粉砕チャンバーを下げた後、さまざまな量の界面活性剤を含む薬剤懸濁液を製品投入口に加えます。懸濁液の最小容量は100 millilitersとしてください。これにより、粉砕チャンバーの過熱を防ぎ、また部品の摩耗を抑えることでビーズ混入を回避できます。

次に、ポンプを始動します。コントロールユニットを使用して、処方に合わせた流量に調整してください。その後、撹拌機をオンにし、コントロールユニットで回転速度を調整します。

速度は分速600回転から4,320回転まで上げることができます。マイクロサー（micro sur）では、研磨チャンバー上部に取り付けられた温度計を使用して温度を監視し、過熱が起こらないようにしてください。次に、さまざまな速度および流量でサンプルをミルし、製剤から約1 mLの少量を分注して、分光光度計Malvern Zeta Sizerを用いた粒径および電荷の測定を行ってください。

目的の粒子径が得られたら、コントロールユニットを使用してミル処理を停止します。ポンプを起動したまま、薬剤が完全に排出されるようにサンプルをフラスコに回収してください。終了後は必ずポンプのスイッチを切り、ビーズを取り出して洗浄してください。次に、ミル懸濁液を50 milliliter遠心チューブに移し、遠心分離機の回転数を10,000 rotations per minuteに設定して30分間遠心分離を行います。

遠心分離サイクルが完了したら、上清の量を測定し、同量の新しい界面活性剤溶液で置換します。再懸濁が完了したら、懸濁液をミリングチャンバーに移し、10分間ミリングします。約1 mLのアリコートを分取し、ゼータサイザーを用いてサンプルのサイズと電荷を再度測定します。

最後に、ホモジナイズによるナノアート作製のため、HPLCを用いてナノアート製剤の濃度を測定します。Avastin Emulex C fiveを用い、前述の方法で薬剤結晶と各種界面活性剤を調製し、懸濁液をホモジナイズ容器に移して再循環を開始します。サンプルのホモジナイズを開始する前に、チラーが作動していることを確認してください。

圧力を徐々に上げ、メーターの読み値が 20,000 ± 2000 PSI になるまで調整し、目標の粒子径に達するまでホモジナイズを継続します。これには通常 45 ～ 60 分かかります。定期的に約 1 mL のアリコートを採取し、前述の方法でホモジナイズした懸濁液の粒子径と電荷をゼータサイザー遠心分離機を用いて測定します。

その後、Resus懸濁液をC fiveホモジナイザーに移します。循環を再開し、ホモジナイズ圧を20,000 ± 2000 PSIに戻し、30分間ホモジナイズします。その後、cold Palmer超音波プロセッサーを用いた超音波処理により製造します。クロロメタンPLGAおよび薬物溶液を1% PVA界面活性剤溶液に注ぎ、超音波処理装置内の氷浴に置きます。

振幅50%で超音波処理を開始します。ただし、サンプル量が少ない場合は振幅を約30%まで下げても構いません。サンプルを10分間超音波処理します。粒子径分析用に少量の分注液を採取します。粒子径が1.5 micronsより大きい場合は、合計で最大16分になるまで、2分間隔でサンプルの超音波処理を繰り返してください。

顕微鏡を用いてサンプルを20倍の倍率で観察し、その結果を記録します。スターラープレートを使用して懸濁液に十分な渦を作り、室温で一晩撹拌し続けます。24時間後に懸濁液を回収し、50 milliliter遠心チューブに注ぎ入れます。

サンプルを8,000 rpmの速度で5°Cにて20分間遠心分離します。上澄み液を除去し、サンプルの一方を75 mLのろ過済み逆浸透水に、もう一方を75 mLの0.5% CTAB（セトリム）界面活性剤にそれぞれ再懸濁します。サンプルを再び8,000 rpmの速度で5°Cにて20分間遠心分離し、各ペレットを合計20 mLのマンニトール溶液で再懸濁します。最後に、ホモジナイズまたは超音波処理のいずれかで製造した粒子について、ZetaSizerを用いて粒子径を測定し、HPLCを用いてサンプルの濃度を測定します。

顕微鏡による可視化の準備として、調製したナノアート懸濁液を取り出し、10秒間ソニケーションを行います。ソニケーションプローブを用いて振幅20%で処理します。顕微鏡スライドのカバーガラスを取り、倒立顕微鏡の上に配置します。カバーガラスの上に。

nano art懸濁液 15 µLにリン酸緩衝生理食塩水 100 µLを加え、ピペッティングにより数回混ぜ合わせます。次に、20倍の対物レンズを用いてナノ粒子の形態を観察します。また、走査電子顕微鏡による観察用にサンプルを調製することも可能です。

ここでは、遠心分離により血中単球を分離し、1×10⁶ cells/mLの濃度で以下の添加剤を補充したDMEMに精製単球を懸濁させた後、A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F 低電圧電界放出形走査電子顕微鏡で得られた画像を示します。次に、6ウェルプレートに1ウェルあたり2×10⁶ cellsを播種し、5% CO2を補充した加湿雰囲気下で7日間培養し、単球をマクロファージへと分化させてから、細胞による取り込みの解析および回収を行います。nano artを培養液で最終濃度100 µMになるように混合し、任意の時点または細胞にnano artが十分に充填された時点で、各ウェルに処理液1 mLを添加します。

処理培地をすべて除去し、細胞に取り込まれなかった粒子を取り除くため、1 mLのPBSで細胞を3回洗浄します。セルリフターを用いてウェルの底から接着細胞を回収し、1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。その後、細胞を4°C、1000 RCFで10分間遠心分離します。

上清を除去し、100%Methanol 200 µLを加えて細胞を溶解させ、ソニックプローブを用いて振幅20%で2～5秒間ペレットを短時間ソニケーションし、nano artを溶解させます。薬物含有量を分析するまで、サンプルを-80 °Cで保存します。ここに示すように、ミクロトームで切片を作成した後、透過型電子顕微鏡を用いてnano artの細胞内保持を可視化することも可能です。

nano arch放出を解析するための詳細については、細胞の取り込みおよび回収の解析について先に述べた方法と同様に、本記事に付随する本文を参照してください。ただし、洗浄後に細胞を回収する代わりに、指定された日、または培地が黄色に変化した時点で、PBSをMCSFおよびnano artを含まない細胞培養液2 mLに交換します。希望する日に培地の半分を交換してください。複製細胞とともに細胞培地1 mLを回収し、薬剤分析に供します。

ナノアート双焦点顕微鏡を用いてリアルタイムの取り込みを可視化するには、まずVibrantなどのDREを採取し、培地に添加します。メーカーの指示に従って、色素含有培地を成熟した単球由来マクロファージに添加し、その後、1 mLの培地を用いて細胞を3回洗浄し、過剰な色素を除去します。次に、蛍光標識したナノアートを培地と混合し、標識ナノアートを含む処理培地を添加します。共焦点顕微鏡によるイメージングの直前から、60倍対物レンズを用いて30秒ごとに4時間、画像をキャプチャします。

最後に、HIV-1感染および感染性アッセイを行うことができます。まず、ART放出の可視化について記載した手順で細胞を処理します。次に、任意の日にすべての培地を除去し、MCSFを含まず、感染多重度（MOI）0.01ウイルス粒子/細胞のHIV-1 $\text{A}_\text{A}$を含む培地と交換し、24時間インキュベートします。

次に、ウイルス含有培地を除去して新しいウイルス培地に交換し、細胞を10日間培養します。その際、感染後10日間細胞を生存させるため、1日おき、または必要に応じて培地の半分を交換します。各ウェルから10 µLの培地を回収して96ウェルプレートに入れ、逆転写酵素解析を行うまで-80 °Cで保存します。その後、HIV-1 p24検出を行うことも可能です。

ここでは、ナノアート処理の1日後、多重感染度0.01でウイルスに曝露した細胞の形態を容易に観察できます。これらの単球由来マクロファージにおいて、ウイルス感染の証拠は見られず、ナノ粒子が細胞質内に明確に確認できます。ここでは、ナノアート処理の10日後に細胞をウイルスに曝露させました。

これらの細胞の一部は、P 24染色および多核巨細胞の形成によって示されるように感染していましたが、未処理の細胞と比較して依然として顕著な保護効果が見られました。Bの細胞の細胞質内には依然としてナノ粒子が視認できますが、aで見られたほどではありません。なお、nano artで処理されていない細胞には、これらの構造は認められません。これらの生細胞共焦点ビデオでは、緑色にラベル付けされたマクロファージと、赤色にラベル付けされたnano artが確認できます。

ここでは、細胞に蓄積されるナノ粒子が非常に少ないことがわかります。一方、こちらでは赤色蛍光の増加が示す通り、粒子が急速に蓄積しています。これらの差は、HPLCを用いて薬剤の取り込みを分析した際に見られる知見と一致しています。さらに、細胞が能動的に粒子を取り込んでいることが確認できます。

細胞内へのナノアート蓄積速度の差は、サイズ、形状、電荷などの物理的特性が、マクロファージのナノアート取り込みおよび保持能力に及ぼす影響を反映しています。このビデオを視聴することで、ウェットミリング均質化および超音波処理技術を用いたナノアートの作製方法について十分に理解できるはずです。これらは、抗レトロウイルスナノ粒子の作製に有効な手法です。

ウェットミリングとホモジナイズは、脂質界面活性剤中で大きな薬物結晶粒子をより小さなナノ粒子に分画するために用いられ、超音波処理技術はポリマー内で個々のナノサイズの薬物液滴を生成します。ここでは、ナノ粒子の輸送を評価するための試験プラットフォームとして、ヒト単球由来マクロファージを使用する方法についても実演しています。本試験法により、粒子の細胞への取り込み、保持、放出能力、およびウイルス複製を抑制する能力を非常に簡便にスクリーニングすることが可能です。

これにより、研究者はin vivoで成功する可能性が最も高く、最終的に感染したヒトへの使用に適したナノアートを特定することができます。これらの実験の完全な結果は、私たちの論文「Online Nano」に掲載されています。この論文は、「Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics」というタイトルで、Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010に掲載されました。

ありがとうございます。