レンチウイルスベクターを用いたマウス腸管オルガノイドへの遺伝子導入

レンチウイルス導入を容易にするため、部分的に分散させたマウス腸管オルガノイドを用いて開始します。

トランスダクション培地に入ったレンチウイルスベクターを用意する。

レンチウイルスは、宿主ゲノムへの安定的な組み込みのための目的遺伝子を運搬します。

レンチウイルスをウェルに添加します。

混合物をインキュベートし、ウイルスの侵入を促します。

ウイルスRNAがDNAに逆転写され、ホストゲノムに組み込まれます。

オルガノイド培地を加え、混合物をチューブに移します。

遠心分離を行い、未結合のウイルスを除去する。

ペレットを基底膜マトリックスに懸濁して混合します。

オルガノイドをウェルに入れ、凝固させます。

マトリックスはネットワークを形成し、オルガノイドを捕捉して構造的なサポートを提供します。

オルガノイドの増殖を促進するため、増殖促進剤を添加したオルガノイド培地を加えます。

これにより、導入遺伝子を含む出芽したオルガノイドが得られ、さらなる機能解析に使用することができます。

この少量に残った培地とともにオルガノイドを48ウェルプレートのウェルに移します。

あらかじめ準備したトランスダクション培地中の高タイターレンチウイルスをオルガノイドに加え、再懸濁します。トランスダクションを進行させるため、オルガノイドとウイルスの混合液を培養インキュベーター内で37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、オルガノイドとウイルスの混合液にオルガノイド培養培地1 mLを加え、再懸濁し、混合液をマイクロ遠心チューブに移して850 x gで5分間遠心分離します。

オルガノイドをペレットにするため、上清を除去し、ペレットを 20 µL の氷冷 Matrigel で再懸濁します。ウェルの中央に液滴を置きます。48ウェルプレートを用い、37 °C で 15 分間インキュベートして液滴を凝固させます。15 分後、ニコチンアミドおよびキナーゼ阻害剤を添加したオルガノイド培養液 250 µL を注意深く加えます。