デュアルアデノウイルス導入を用いたSMADパスウェイ活性化の検出

乳がん細胞の培養物を用意する。

2種類のアデノウイルスを共感染させます。一方のウイルスは、構成的に活性なプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を保持しています。

もう一方は、SMAD応答性プロモーターの制御下にある赤色蛍光タンパク質（RFP）をコードするレポーター遺伝子を含んでいます。

試験培養液にTGF-betaを添加し、インキュベートする。

ウイルスが受容体に結合して宿主細胞に侵入し、遺伝子を核内に導入することで、GFPの発現を可能にします。

試験細胞において、TGF-betaは受容体に結合し、タンパク質SMAD2およびSMAD3をリン酸化することでSMAD経路を活性化します。

これらのタンパク質はSMAD4と複合体を形成します。

この複合体がレポーター遺伝子のプロモーターに結合することで、GFPに加えてRFPの発現が可能になります。

コントロールでは、SMADパスウェイが不活性なままであり、細胞はGFPのみを発現します。

生細胞の蛍光画像を撮影します。

両方のシグナルが検出されることで、デュアルアデノウイルス導入によるSMAD経路の活性化が確認されます。

アデノウイルス感染当日、12ウェルプレートの各ウェルに、約1.25 × 10⁵個のMDA-MB-231細胞を50 μLの培地で播種し、コンフルエンシーを35%にします。すべてのウェルの細胞に、アデノウイルス-CMV-GFPを75 μL、アデノウイルスCAGA12-Td-Tomatoを7.5 μL添加し、感染陽性率10%を達成可能な2,50 MOIで感染させます。その後、アデノウイルス感染直後に処置ウェルへTGF-βを添加します。

37 °C、10% 二酸化炭素条件下で24時間インキュベートします。翌日、位相差蛍光顕微鏡を用いて生細胞のイメージングを行います。