感染ヒトリンパ球におけるウイルス核酸およびタンパク質の多重蛍光イメージング

スライドに固定したカバーガラス上の、HIV-1に感染させたヒトリンパ球を用いて開始します。

これらの細胞は、ウイルスRNAおよびプロウイルスDNAを蛍光標識するプローブでハイブリダイゼーションされています。

抗体の非特異的結合を防ぐため、細胞をブロッキング溶液中でインキュベートします。

HIV-1カプシドタンパク質を標的とする一次抗体を導入します。

一次抗体がカプシドタンパク質に結合するまでインキュベートします。

未結合の抗体を 제거するために、バッファーで細胞を洗浄します。

一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体を添加します。

未結合の抗体を洗い流します。

DNA特異的染料を加えて細胞核を染色し、その後、洗浄して過剰な染料を除去します。

マルチプレックス蛍光イメージングを用いて、ウイルスDNA、RNA、タンパク質、およびホストの核をそれぞれ異なる色で同時に検出します。

この単一細胞可視化により、感染細胞におけるウイルスのDNA、RNA、およびタンパク質を同時に可視化することで、ウイルスライフサイクルの異なる段階を研究することが可能になります。

目的タンパク質の免疫染色のために、最後の洗浄後、各カバーガラスに20 µLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、ブロッキングバッファーを除去し、1% 牛血清アルブミンを添加したPBS plus Tween 20で希釈した目的の一次抗体 20 microliters を加えます。室温で1時間インキュベートした後、新鮮なPBS plus Tween 20を用いて、1回10分間の洗浄を2回、振盪しながら行います。その後、適切な二次抗体を用いて室温で1時間標識します。インキュベーション終了後、新鮮なPBS plus Tween 20を用いて、1回10分間の洗浄を2回、振盪しながら行います。

2回目の洗浄後、適切な核染色剤を用いて室温で1分間核を対比染色し、続いてPBS中で室温にて振盪しながら10分間の洗浄を2回行います。