メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

この手順の全体的な目標は、メタゲノムライブラリーからクローンを発現するセルラーゼを同定することです。これは、最初にロボットを使用して以前に作成したメタゲノムライブラリを複製し、複製されたライブラリを摂氏37度で24時間インキュベートすることによって達成されます。大腸菌クローンの増殖を測定し、溶解、バッファー、および基質を複製ライブラリーに添加します。

最終的には、プレートリーダーを使用した比色吸光度測定を通じてセルラーゼ活性を示す結果を得ることができます。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部のスティーブン・ハラム研究室のキースです。本日は、メタゲノムライブラリーのハイスループット機能スクリーニングの手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、メタゲノムライブラリからのバイオミンセルラーゼ活性を研究しています。それでは始めましょう。このプロトコールを開始する前に、384ウェルプレートフォーマットで保存したメタゲノムライブラリーを調製してください。

この研究では、PCC one コピー コントロール SMID ベクターと Farge T one 耐性 TRANSFECT max EPI 300 T one 耐性大腸菌細胞をライブラリ ホストとして組み合わせてこの手順を開始し、ライブラリを含むプレートを摂氏マイナス 80 度から取り出し、摂氏 37 度で約 20 分間解凍します。その間、QIX 2のUV光滅菌機能を使用して、ロボットを15分間滅菌します。メーカーの指示に従って、滅菌チューブプログラムを介してマニホールドに取り付けられたメディアボトルを使用してQフィル3をセットアップします。

Qは、適切な量のメディアに対して3つを満たし、45マイクロリットルの容量を満たすように設定します。それぞれで、ロボットのパージ機能を使用して、メディアが見えるまでチューブとマニホールドから空気を十分にパージします。マニホールドの各ピンで、Q fill three を使用して、必要な数のプレートを LB メディアに充填します。

各プレートの充填には約20秒かかります。次に、ライブラリプレートと新しいプレートをQピックの適切な領域にロードします。ロボットで洗浄槽に適切な試薬を充填します。

リアバスに2%マイクロ90、ミドルバスにオートクレーブ蒸留水、フロントバスに80%エタノール。qix twoの複製プログラムを使用して、適切なヘッドと、ソースプレートとデスティネーションプレートの両方の数とタイプを選択します。また、レプリケーション間でクリーンアップするようにヘッドを設定します。

通常、各バスで6サイクルで十分です。機械の容量は一度に10枚のプレートです。実行するマシンを設定します。

レプリケートには約 15 分かかります。384ピンヘッドでフルキャパシティ。プレートが複製されたら、湿度ボックスでプレートを摂氏37度で24時間成長させます。

アラビノースの添加によりsmidのコピー数が多く誘導されるため、長いインキュベーション時間が必要です。その間、Qフィル3ロボットは、書かれたプロトコルに記載されているように清掃します。インキュベーション後、プレートを摂氏37度のインキュベーターから取り出します。

蓋を脇に置き、プレートをラピッドスタックを備えたマガジンローディングプラットフォームに置きます。ソフトウェアでは追跡できないため、プレートの順序を追跡してください。スタックの下部にあるプレートが読み取られます。

まず、ラピッドスタックからマガジンを1つ取り出します。空であることを確認し、読み取るプレートのスタックに押し込みます。マガジンのハンドルをつかむと、プレートがマガジンにロードされます。

マガジンを正しい向きでラピッドスタックにロードします。接続されたコンピューターでスキャンプログラムを開きます。新しいセッションを選択し、適切な名前を付けます。

プレートとしてフラットボトム384ウェルプレートを呼び出すことを選択します。プレートレイアウト領域に入力します。ウィザードボタンを選択し、それを選択してプレートに384の未知数を追加します。

プロトコル領域で、ウェルループオプションを選択し、384ウェルを入力します。ウェルループアイコンが画面の左側にあるフローツリーに表示されます。アイコンを選択し、クリックして測光測定を追加します。

600ナノメートルで読み取るように設定します。プロトコルを一意の名前で保存し、スキャンをその再プログラムを閉じます。次に、polara RSプログラムを開きます。

メインページの[VARI Scan]見出しの下に、ラピッドスタックデバイスに接続されている機器をリストしたテーブルがありますので、[run session]オプションをクリックします。その後、アッセイウィンドウが表示され、中央にフローチャートが表示されます。実行セッション項目を選択し、保存したスキャンの名前を見つけます。

画面の右側に表示されるドロップダウンメニューで再実行されます。プロトコルを選択したら、[実行] をクリックします。このアッセイでは、どのマガジンをソースとして使用するか、どのマガジンが空であるかを尋ねるボックスがポップアップ表示されます。

画面下部のボックスは、フロントマガジンのZINEに対応しています。ラピッドスタックとVarioスキャンの両方がオンになっていることを確認し、開始をクリックします。ラピッドスタックは、プレートを自動的にプレートリーダーにロードし、プレートの連続測定を可能にします。

Varioスキャンへの最初のプレートのロードを観察して、読み取るマシンの適切な位置合わせを確認します。25枚のプレートには約50分かかります。Barriosのスキャンが終了したら、フルマガジンを取り外してマガジンローディングプラットフォームに置きます。

プラットフォームの外側の長方形を持ち上げると、マガジンが滑り落ち、プレートが中央に山積みになったままになります。最後に、プレートの蓋を元に戻し、ソリューションベースのスクリーンに交換します。セルロース活性については、まず、既製の10倍の溶解ストックを使用してアッセイミックスを調製します。

書面によるプロトコルに記載されているように、pH 5.5で50ミリモルの酢酸カリウム緩衝液を混合します。次に、DMSO中に最大75ミリグラム/ミリグラム/リットルの発色性ジフェニルまたはDNP細胞殺生物剤基質のストックを調製し、基質が完全に溶解していることを確認します。DNP細胞殺生物剤ストック溶液をアッセイミックスに添加し、最終濃度0.1ミリグラム/ミリリットルにします。

各プレートは約20ミリリットルの溶液を使用し、デッドボリュームを可能にするためにさらに50ミリリットルが必要であることに注意してください。Q fill threeを使用して各プレートに混合するアッセイで、前回と同様にQ fill threeをセットします。各プレートの充填には約20秒かかります。

アッセイミックスを加えたら、プレートを摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。湿度ボックスで、摂氏37度のインキュベーターからプレートを取り出します。蓋を脇に置き、以前と同じ方法で、ラピッドスタックを備えたマガジンローディングプラットフォームにプレートを置きます。

スキャンプログラムを開き、400ナノメートルで読み取るように設定する必要がある測光測定を除いて、以前に行ったように設定します。次に、パラメータをPOLARARARSプログラムに入力します。前に示したように。

Varioスキャンでプレートを読み取ることができます。実行後、プレートを取り外して廃棄します。吸光度の読み取り値を開いた状態でエクスポートするには、ソフトウェアをスキャンして選択します。

既存のファイルを開きます。セッションが保存されたディレクトリを選択し、プラスアイコンをクリックしてリストを展開します。タイトル見出しの下には、コンテナ1からコンテナN.Typesというラベルの付いたオプションが表示されます。プレートの数に応じて、ページ上部のメニューバーで分析する最初のプレートを選択し、データレポートのエクスポートを選択します。

プレートのレイアウトや測光データなど、エクスポートのオプションを選択します。[レポートの表示] をクリックし、次に [ファイルの保存] をクリックします。目的のディレクトリを選択します。

出力形式は Microsoft Excel スプレッドシートです。ここでは、単一の384からの吸光度の読み取り値です。示されているように、ポジティブクローンを含むウェルプレートは、セルラーゼ活性を発現しないクローンと比較して、吸光度の顕著な増加を示す。

アッセイ時間、ウェル、プレート上の位置、またはDNP濃度の違いは、絶対吸光度の読み取り値に影響を与える可能性があります。プレート平均またはカラム平均を超える吸光度の差などの相対吸光度測定値は、セルラーゼ陽性クローンを同定するより堅牢な方法です。メタゲノムライブラリーからセルラーゼ陽性クローンを同定する方法をお見せしました。

この手順を実行するときは、DNP細胞バイオ側をDMSOに溶解し、プレートを湿度チャンバーでインキュベートすることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。