サイズ排除クロマトグラフィーによるプロトタイプフォーミーウイルス・インタソームの精製

プロトタイプフォーミーウイルス（PFV）インタソームの沈殿物、モノマー状インテグラーゼ、DNAオリゴマー、およびタンパク質凝集体を含む懸濁液から開始します。

PFV インタソームは、ウイルスゲノムDNAを模倣した合成オリゴマーと複合体を形成したウイルスインテグラーゼのテトラマーである。

懸濁液に塩溶液を加え、氷上でインキュベートします。塩はインタソーム間の静電相互作用を減少させ、沈殿物の可溶化を促進します。

インタソームの溶解を促進するため、定期的に穏やかにピペッティングしてください。

遠心分離して残りの沈殿物をペレット化し、可溶性インタソームを含む上清を回収します。

あらかじめ平衡化した架橋アガロースビーズ充填サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用意し、上清をカラムにロードします。

タンパク質凝集体およびインタソームはサイズが大きいため、ビーズの細孔を通過せず、より早く溶出します。

より小さな単量体のインテグラーゼおよびオリゴマーはビーズの細孔に入り込み、より遅く溶出します。

インタソームを含む早期溶出画分を回収し、以降の下流解析に使用する。

清潔な表面で、新しいカミソリまたはメスを用いて200 µLチップの先端から2〜4 mmを切り取り、ワイドボアピペットチップを2本用意します。透析チューブを透析緩衝液から取り出します。クリップ付近のチューブ末端に残っている可能性がある透析緩衝液によってインタソーム試料が希釈されるのを防ぐため、小さなピペットチップを装着したマイクロピペットを使用して、余分な透析緩衝液を除去します。

透析チューブのこの端からクリップを取り除きます。複合体を回収する際は、溶液と沈殿物をできるだけ多く回収することが重要です。ワイドボアピペットチップを使用して、透析チューブ内の沈殿物を含むサンプルを、氷上の1.5 milliliterチューブに移します。

回収した物質の全量を確認してください。全量は通常、約 140 µL です。沈殿物を含むサンプル中の NaCl 濃度は 200 mM です。

5 M 塩化ナトリウムストック溶液を適切な量添加し、塩濃度を最終濃度 320 mM 塩化ナトリウムまで上げます。サンプルを入れたアイスバケットを 4 ˚C の低温室に移動させます。ワイドボアピペットチップを用いて、ピペッティングにより沈殿物を再懸濁および可溶化させます。

これを少なくとも1時間、20分ごとに繰り返します。沈殿物の大部分が溶解することを確認してください。インタソームを精製するために、架橋アガロースサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムを、SECランニングバッファーを用いて0.4 mL/minの流速で平衡化します。

インタソーム試料をマイクロ遠心機を用いて 14,000 ×g で 10 分間、4 ˚C で遠心分離し、残存する沈殿物をペレット化します。上清を慎重に回収し、200 µL インジェクションループにロードします。その後、試料を SEC カラムに適用します。

25 mLのSECランニングバッファーで溶出し、270 µLずつ95フラクション回収します。SECクロマトグラムにA280およびA260の3つのピークが表示されることを確認してください。