リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析用ウイルスRNAの抽出

培地で連続希釈した合成ウイルスRNA標準溶液を用意します。

これらの希釈液は、サンプル中のウイルスRNAを定量するための参照標準として使用します。

それでは、ウイルス感染させた細胞培養液から、ウイルスを含む上清を採取します。

この培地には、RNA分解酵素に結合してウイルスRNAの分解を防ぐ阻害剤が含まれています。

proteinase K酵素を含む処理バッファーを添加します。

溶液を軽く遠心分離し、均一に混合します。

サンプルが入ったPCRプレートをサーモサイクラーにセットします。

まず、中程度の温度でインキュベートし、proteinase Kを活性化させます。

この酵素はゲノムを包み込んでいるウイルス蛋白を消化し、ウイルスRNAを溶液中に遊離させます。

次に、より高い温度でインキュベートし、酵素を不活化させてRNAを変性させます。

最後に、リアルタイム定量PCR分析を行うまで、処理済みサンプルを冷所で保存します。

まず、199 µLの処理バッファーと1 µLのヌクレアーゼフリープロテイナーゼKを混合します。細胞培養培地を用い、ピペッティングとボルテックスを繰り返すことで、調製したデングウイルス3'UTR RNAを1:10で段階希釈し、5 x 10⁹から5 x 10³ copies/µLの濃度のRNA標準溶液を作成します。デングウイルス感染細胞の培養上清およびデングウイルス3'UTR RNA標準溶液をそれぞれ5 µLずつ、8本チューブPCRストリップまたは96ウェルPCRプレートのウェルに分注します。

プロセッシングバッファーとproteinase Kを含む溶液を5 µL加えます。200 ×gで5秒間、短時間遠心分離します。サーモサイクラーを用いて、サンプルを25 °Cで10分間、次いで75 °Cで5分間インキュベートします。