有精卵の尿膜液からのウイルスの精製

ウイルス感染させた鶏卵から採取した尿膜液を入れたリザーバーを用意します。

この液体には、ウイルス粒子とともに宿主由来の不純物が含まれています。

液体をデプスフィルターに通し、小さな不純物やウイルスを透過させつつ、大きな不純物を捕捉します。

次に、ろ過された液体をろ過システムにロードし、膜表面に沿って接線方向に流します。

より小さな不純物は膜を通過し、ウイルスは保持されて濃縮されます。

濃縮したウイルスを密度勾配にロードし、遠心分離を行います。ウイルスは、自身の密度が勾配と一致する位置に明確なバンドを形成します。

ウイルスが濃縮されたバンドを透析カセットに回収し、緩衝液に浸します。これにより、半透膜を通じて緩衝液から水が拡散して流入し、一方で勾配成分が拡散して外部へ排出されます。

次に、カセットを高張液に浸し、水分を抽出して精製ウイルスを濃縮します。

ニューカッスル病ウイルス（NDV）を精製するには、まず、あらかじめセットした実験システムに 50 milliliters の PBS を流してプライミングを行います。

チューブ内にPBSが約5 mL残った時点でポンプを停止します。次に、1〜3 µmの保持定格を持つデプスフィルターをチューブに取り付けます。フィルター内を脱気するため、デプスフィルター上部の2つ目のキャップを取り外し、さらに50 mLのPBSをシステムに通します。

PBSがフィルター上部のベントから流れ始めたら、ポートを閉じてラインにPBSを流し続けます。その後、廃棄容器を新しい滅菌回収容器に交換し、オールアント液をデプスフィルターに通し始めます。次に、タンジェンシャルフローろ過（TFF）システムをオープン構成でセットアップし、論文に記載されている通りに実行します。

リザーバー内の液量が約5 mLになったら、ポンプを一時停止し、深度ろ過済みの尿囊液をリザーバーに補充します。その後、ポンプのフローを再開します。ウイルスのせん断を防ぐため、システムの圧力が10 psiを超えないようにすることが重要です。

溶出量を増やすには、ペリスタルティックポンプの速度とCクランプを組み合わせて調整してください。リザーバーに150から100 millilitersのallantoic fluidが残った時点でポンプを一時停止し、150から200 millilitersのML bufferを加えてバッファーを交換します。再度、リザーバーに5から10 millilitersの液体が残った時点でポンプを一時停止し、2つのCクランプを使用して廃棄ラインを閉じます。

リザーバーに供給しているリテンテートラインを取り外し、50 mLコニカルチューブに挿入します。その後、流れを再開し、リザーバータンク内の液体が数滴になった時点で停止させます。次に、廃棄ラインからCクランプを取り外し、リテンテート供給ラインをリザーバータンクに再接続します。

一方、イオジキサノール密度勾配超遠心分離の準備として、まず 0.5 milliliters の 40% iodixanol を 13.2 milliliter のオープントップ薄壁超遠心管に加えます。次に、2.5 milliliters の 20% iodixanol と 2.5 milliliters の 10% iodixanol を順次加えて、カラムを準備します。超遠心分離の前に、勾配を乱さないように注意しながら、TFF システムから溶出した 6 から 6.5 milliliters のウイルス溶液をイオジキサノールカラムに加えます。

超遠心分離後、滅菌済みのピンセットを用いてチューブを取り出します。目的のバンドは、10%から20%の勾配の間にある大きなバンドとして観察されるはずです。次に、レトルトスタンドを用いて、ビーカーの上にチューブを吊り下げます。

その後、18ゲージの1.5インチ針を5 mLシリンジに取り付け、超遠心管の側面を針で刺し、プランジャーをゆっくりと引いて目的のバンドを回収します。原稿に記載されている通りにウイルス溶液からiodixanolを除去した後、シリンジを用いてウイルスを透析カセットに慎重に注入します。ウイルス溶液を濃縮するために、透析カセットを透析バッファーから取り出し、小さな密封可能なプラスチック袋に入れます。

次に、透析カセットが完全に浸るように、40% polyethylene glycolを15から25 millilitersバッグに加えます。