センダイウイルスを媒介としたヒト血液細胞から人工多能性幹細胞へのリプログラミング

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の培養物を用意する。

リプログラミング転写因子をコードするSendai virusを添加します。プレートにカバーをかけ、密閉します。

ウイルスと細胞の接触を促進するために遠心分離し、インキュベートします。

ウイルスの融合後、ウイルスRNAが転写因子を発現し、これにより細胞の多能性遺伝子が活性化され、リプログラミングを開始させるために系統特異的遺伝子が抑制されます。

この間に、導入されたPBMCの一部が人工多能性幹細胞（iPSC）へと転換し、接着タンパク質を発現します。

細胞をマトリックスコートしたウェルに移し、遠心分離して細胞を沈殿させます。上清を増殖培地に交換します。

インキュベーション後、iPSCはマトリックスに接着し、形質導入された非接着性のPBMCは懸濁したままとなります。

懸濁液をコート済みウェルに移し、遠心分離します。元のウェルに培地を加え、両方をインキュベートします。

残りの導入済みPBMCがリプログラミングを開始し、iPSCへと変換されて接着します。このステップにより、リプログラミングされた細胞の回収率が最大化されます。

iPSCの増殖を維持するため、培地を毎日交換してください。

この手順では、血球を15 mlコニカルチューブに移し、血球計数計を用いて細胞数を数えます。次に、導入用に3 x 10⁵個の細胞を準備し、室温で515 x gで5分間、細胞を遠心分離します。

その後、吸引により上清を除去し、0.5 mlの血液細胞培地で細胞を再懸濁します。次に、細胞をコートされていない24ウェルプレートのウェルに移します。氷上でセンダイウイルス混合液を融解し、懸濁細胞に添加します。

プレートをシーリングフィルムで密閉し、30 °Cで1,150 ×g、30分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、24ウェルプレートにビトロネクチンでコーティングするため、ビトロネクチン溶液をPBSで希釈し、最終濃度を5 µg/mlにします。

次に、1 mlのビトロネクチンをウェルに加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。その後、コーティング溶液を除去し、細胞とウイルスを含むすべての培地をコーティング済みウェルに移します。次に、さらに0.5 mlの新鮮な血液細胞用培地で残りの細胞を回収し、細胞が入ったウェルに加えます。

続いて、プレートを 1,150 ×g で 35 °C、10 分間遠心分離し、その後、細胞を 37 °C、5% CO2 下で一晩（O/N）培養します。2回目の細胞転移では、前述の手順に従い、ウェルを 5 µg/ml のビトロネクチンでコートします。各導入につきプレートの1ウェルを使用し、1枚目のプレートから細胞懸濁液を新しくコートしたビトロネクチンプレートに転移します。

その間に、維持のために最初のプレートのウェルに1 mlのiPSC培地を加え、37 °C、5% CO2でインキュベートし、新鮮なiPSC培地で毎日培地交換を行います。導入後14日から21日でコロニーが出現します。浮遊細胞を含む新しくコーティングしたプレートを、35 °Cで1,150 ×gにて10分間遠心分離します。

遠心分離後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、上清を除去し、新鮮なiPSC（人工多能性幹細胞）培地に交換します。接着細胞は、コンフルエンスが80%に達するまで、毎日培地交換を行って維持します。