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ヒト肺上皮細胞を含むチューブを用意します。
ビオチン化インフルエンザウイルスを添加し、氷上でインキュベートします。これにより、ウイルスは細胞内に取り込まれることなく細胞表面に結合します。
遠心分離してウイルス結合細胞を分離し、上清を除去して再懸濁します。
最初のタイムポイントのチューブに、ビオチン化ウイルスに結合して複合体を形成する、標識されていないストレプトアビジンを加えます。
蛍光標識ストレプトアビジンを添加します。これはストレプトアビジン-ビオチンウイルス複合体には結合しません。その後、細胞を洗浄し、固定します。
より遅いタイムポイントのチューブをより高い温度でインキュベートしてウイルスの内部移行を促進させた後、氷上にに戻します。
ラベルなしのstreptavidinと、ウイルスのさらなる取り込みを防ぐ内部移行阻止剤を添加し、インキュベートします。Streptavidinが細胞表面に結合したビオチン化ウイルスに結合するため、その後洗浄を行います。
細胞を固定し、界面活性剤含有バッファーを加えて透過処理を行います。
洗浄後、細胞内に進入してビオチンに結合する蛍光標識ストレプトアビジンを添加します。
フローサイトメトリーを用いてサンプルを分析します。
後方のタイムポイントで蛍光強度が高くなることで、ウイルスの内部移行が成功したことが確認されます。
洗浄をもう一度繰り返した後、チューブを氷上で10分間冷却します。チューブが冷却されたら、再度遠心分離を行い、感染用PBSで希釈したビオチン化ウイルス100 microlitersを用いてペレットを再懸濁し、氷上で1時間インキュベートします。その後、再び遠心分離を行い、PBSで2回洗浄します。0分時点のサンプルについては、可能な限り他のサンプルと並行して処理してください。
0分＋STVサンプルを処理するには、チューブを遠心分離し、上清を除去した後、15 µLのSTV（2% BSAおよび0.1%アジ化ナトリウム含有PBS）を用いて細胞ペレットを再懸濁します。氷上で30分間インキュベートしてください。その後、遠心分離し、先ほど示した通りPFAで固定した後、PBSで細胞を2回洗浄し、サンプルを4 °Cで保存します。
30分以上のSTVサンプルについて。ペレット化後、37°Cで30分間インキュベートし、サンプルを200 µLのPBS 2% BSAに再懸濁します。
細胞を遠心分離し、PBSにSTV 2% BSA 0.1% Sodium azideを含む50 µLの溶液で再懸濁し、洗浄および固定を行う前に氷上で30分間インキュベートします。次に、テキストプロトコルの詳細に従い、すべてのサンプルを透過処理しSTV-Cy3で染色した後、サンプルを4 °Cで保存します。最後に、フローサイトメトリーでサンプルを解析します。