ヌクレオシドアナログを用いた複製中HSV-1ゲノムの標識

DNA複製が最小限である静止期の哺乳類細胞培養を用い、条件化培地を回収する。

単純ヘルペスウイルス（HSV）を添加し、ウイルスが付着するように時々揺らしながらインキュベートする。洗浄して未結合のウイルスを除去し、調整済みの培地を戻す。

インキュベーション後、ウイルスは宿主細胞の膜と融合し、ヌクレオカプシドを細胞質に放出します。

ウイルスdsDNAが核内に進入して環状化し、ウイルスDNA複製に必要なウイルスタンパク質を発現します。

ウイルスおよび宿主タンパク質がウイルスDNAを解き、RNAプライマーを合成します。次に、ウイルスDNAポリメラーゼ複合体が結合し、プライマーを伸長させてDNA合成を行います。

複製が進むにつれて、ヌクレオシドアナログを培養液に添加します。これは細胞内に取り込まれ、三リン酸形式に変換されます。

宿主のDNA複製は最小限であるため、アナログは複製中のウイルスDNAに優先的に取り込まれ、ウイルスゲノムが標識されます。

ラベル化されたウイルスゲノムは、関連タンパク質のダウンストリームプロテオミクス解析に使用可能な状態になります。

テキストプロトコルに従い、MRC-5細胞の培養からこの手順を開始します。次に、HSV-1を冷えたTris緩衝生理食塩水（TBS）で希釈します。以下のステップでは、細胞の乾燥を防ぐため、ブロワーと組織培養フードの電源を切ることが重要です。

ピペットを使用して、MRC-5細胞の増殖培地を滅菌ボトルに移し、感染後に細胞へ戻せるようにしておきます。7 mLの希釈ウイルスを細胞に添加して感染させます。室温で1時間、10分おきに細胞を揺らしてください。

吸着後、接種物を吸引し、細胞を室温のTBS 50 mLで洗浄し、元の増殖培地に戻します。その後、37 °C、5% CO2条件下で細胞をインキュベートします。ウイルスDNA複製が開始した感染後約4時間後に、複製中のウイルスDNAをラベルします。

そのため、EdCを1 mLの増殖培地で希釈し、感染細胞の細胞培養培地に添加して2〜4時間おきます。